【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于低聚糖加工，具体涉及一种固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、随着现代人们生活水平的提高，对健康的认知日益增多，人们逐渐认识高糖食物的危害，逐渐追求低糖、低热量的食品。
2、稀有单糖d-阿洛酮糖是d-果糖的c-3差向异构体，具有低热量、低吸收特点，是目前最具市场和研究价值的具有保健功能的稀有糖。作为一种代糖，阿洛酮糖是一种低能量甜味剂，它的甜度为蔗糖的70%，但热量只有蔗糖的0.3%。阿洛酮糖的安全性已经得到包括美国食品药品监督管理局在内的多国监管机构的认可，可以用于多种食品。作为一种功能糖，具有减少膳食d-果糖和d-葡萄糖糖的吸收、增强胰岛素抵抗、抗肥胖活性、降血脂等生理功能。
3、阿洛酮糖的化学合成法具有分离困难、副产物多、化学废物的产生等较难克服的难点。因此，绿色环保的生物酶法生产逐渐受到世界范围内广泛的关注。d-阿洛酮糖的生物合成路径主要有3条：（1）经d-塔格糖3-差向异构酶酶(d-tagatose 3-epimerase，dte)或d-阿洛酮糖3-差向异构酶(d-psicose 3-epimerase，dpe)催化d-果糖得到d-阿洛酮糖；（2）经葡萄糖异构酶(glucose isomerase，gi)催化d-葡萄糖为d-果糖，d-果糖再经路径(1)得到d-阿洛酮糖；（3）经氧化还原酶催化阿洛醇得到阿洛酮糖。目前，生物合成d-阿洛酮糖主要是由d-阿洛酮糖3-差向异构酶催化d-果糖得到。d-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达系统常用的是大肠杆菌、枯草芽孢
4、使用微生物生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶，并通过整体细胞或粗酶的批次转化工艺，将果糖转化为d-阿洛酮糖，通常酶的半衰期短、稳定性差、转化效率低，且只能利用一次，酶的利用率极低。通过固定化酶的概念，可以实现酶的连续转化及利用效率的提高。
技术实现思路
1、针对现有技术中d-阿洛酮糖3-差向异构酶的半衰期短、稳定性差、转化效率低的问题，本专利技术提供了一种固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其制备方法和应用，有效提高酶的稳定性、转化效率及利用效率，提高生产效率，显著降低生产成本。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、一种固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，包括以下步骤：
4、（1）硅藻土的改性：用水清洗天然硅藻土，清洗后加入碱液反应，反应结束后用水漂洗至ph中性，烘干，然后加入稀盐酸、钴盐、镁盐，于350~400℃先焙烧，冷却，加水漂洗至中性，烘干得改性硅藻土；
5、（2）酶的固定：向改性硅藻土中加入d-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液，于40℃下震荡孵育，弃去液体，得固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶。
6、进一步地，步骤（2）中d-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液是枯草芽孢杆菌发酵获得的d-阿洛酮糖3-差向异构酶粗酶液，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis) ，编号为blb-12-b，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no .24054。
7、进一步地，步骤（1）中的碱液为1~2mol/l的氢氧化钠溶液，加入量为硅藻土体积的2~3倍。
8、进一步地，步骤（1）中加入碱液后的反应时间为4-6h。
9、进一步地，步骤（1）中稀盐酸的浓度为1-2 mol/l，加入量为硅藻土体积的1-1.2倍。
10、进一步地，步骤（1）中钴盐氯化钴，镁盐为硫酸镁；钴盐的加入量为0.5~1 kg/m3硅藻土、镁盐的加入量为1.0~1.5 kg/m3硅藻土。
11、进一步地，步骤（1）中焙烧时间为2~3h。
12、进一步地，步骤（2）中d-阿洛酮糖3-差向异构酶粗酶液酶活为2500~2800 u/ml；改性硅藻土中与d-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液的体积比为1:2~5。
13、本专利技术中，所述的固定方法得到的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶。
14、本专利技术中，所述的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶在制备d-阿洛酮糖中的应用。
15、将本专利技术中制备的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶填充于柱式填充床中，用去离子水溶液配制成浓度为55-60%的d-果糖溶液，d-果糖液的流速是1-1.5倍柱体积每小时，30-50℃保温，得d-阿洛酮糖粗液，经活性炭吸附、钙型色谱树脂进行六柱模式顺序式间歇运行纯化分离，然后进行脱色离交降低电导、真空浓缩和干燥得d-阿洛酮糖。
16、本专利技术取得的有益效果为：
17、（1）本专利技术中的载体材料为硅藻土，绿色环保，易获得，生产成本低，且硅藻土作为催化剂提供有效的表面和合适的孔结构，改性后的硅藻土不仅孔隙更加发达，还结合了d-阿洛酮糖生产必须的钴离子和镁离子，避免了料液中金属离子的添加；
18、（2）本专利技术中的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶不仅提高了酶的机械强度和热稳定性，保证d-阿洛酮糖3-差向异构酶在高温下不失活，硅藻土还能够提供抑菌活性；
19、（3）本专利技术制备的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶，与游离酶相比，ph稳定性显著提升，转化过程可采取批次或连续反应，大幅提升酶的重复使用率或使用周期，降低生产成本，具有广泛应用前景；
20、（4）本专利技术制备的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶在制备d-阿洛酮糖时，不需高温灭酶，节约能源，料液产生色素少，活性炭使用量少，且减少了金属离子的添加，料液电导低，减轻了离交压力，利用连续离交走料，可以降低产品电导≤10 μs/cm，需要色谱前的脱色离交，节约了大量成本，使用钙型色谱树脂进行色谱分离纯化，产品纯度可以达到≥98%。
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1.一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（2）中D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液是枯草芽孢杆菌发酵获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶粗酶液，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ，编号为blb-12-B，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No .24054。
3.根据权利要求1所述的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（1）中的碱液为1~2mol/L的氢氧化钠溶液，加入量为硅藻土体积的2~3倍。
4.根据权利要求1所述的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（1）中加入碱液后的反应时间为4-6h。
5.根据权利要求1所述的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（1）中稀盐酸的浓度为1-2 mol/L，加入量为硅藻土体积的1-1.2倍。
6.根据权利要求1所述的固定化D-阿洛酮糖3-
7.根据权利要求1所述的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（1）中焙烧时间为2~3h。
8.根据权利要求1所述的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（2）中D-阿洛酮糖3-差向异构酶粗酶液酶活为2500~2800 U/mL；改性硅藻土中与D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液的体积比为1:2~5。
9.一种权利要求1~8任一项所述的固定方法得到的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
10.一种权利要求9所述的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶在制备D-阿洛酮糖中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（2）中d-阿洛酮糖3-差向异构酶酶液是枯草芽孢杆菌发酵获得的d-阿洛酮糖3-差向异构酶粗酶液，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis) ，编号为blb-12-b，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no .24054。
3.根据权利要求1所述的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（1）中的碱液为1~2mol/l的氢氧化钠溶液，加入量为硅藻土体积的2~3倍。
4.根据权利要求1所述的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，步骤（1）中加入碱液后的反应时间为4-6h。
5.根据权利要求1所述的固定化d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李克文，栾庆民，韩乐闪，于潇頔，薛雅莺，袁世英，孔刘娟，吕志超，李明明，吴敬，
申请(专利权)人：保龄宝生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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