【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1、植物黄萎病是危害较为严重的维管束病害，其病原菌主要为大丽轮枝菌(verticillium dahliae)和黑白轮枝菌(verticillium alboatrum)，为半知菌亚门、淡色孢科、轮枝菌属。大丽轮枝菌由于寄主极其广泛，对高温和剧烈温度变化的适应能力较强，所以在棉花等众多感染黄萎病的植物上的主要致病菌均为大丽轮枝菌。大丽轮枝菌在与自然界宿主的长期互作和竞争中进化出一套巧妙的侵染系统，通过分泌一些效应因子，各司其职，分工合作，躲避免疫识别并成功入侵宿主。大丽轮枝菌在土壤中萌发并从寄主根部定殖进入内部，一般化学药剂很难对其发挥作用。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白及其制备方法和应用，使用基因工程体外重组蛋白作为农药来防治棉花黄萎病，激活了植物自身的免疫反应，绿色无毒，无农残，对预防黄萎病更为简单有效。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白，所述病原菌为大丽轮枝菌，所述蛋白为大丽轮枝菌n85基因在原核表达系统中表达的天冬酰胺n-糖基化修饰缺陷的重组蛋白。
4、优选地，所述原核表达系统为大肠杆菌系统。
5、一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白的制备方法，包括以下步骤：
6、步骤1)设计上下游特异性引物pcr扩增大丽轮枝菌n85基因的cdna，连接到
7、其中，所述大丽轮枝菌n85基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述特异性引物的核苷酸序列如seq id no.2-3所示；
8、步骤2)将步骤1)构建的质粒pet-28a::n85转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布含有卡那霉素的lb平板培养基并培养，挑取大肠杆菌阳性单菌落备用；
9、步骤3)将步骤2)得到的大肠杆菌阳性单菌落转入含有卡那霉素的液体lb培养基中振荡培养，取培养物转接到含有卡那霉素的液体lb培养基中振荡培养，加入异丙基硫代半乳糖苷，诱导表达，得到大肠杆菌细胞；
10、步骤4)离心收集步骤3)得到的大肠杆菌细胞，用磷酸盐缓冲液充分悬浮洗涤菌体，再离心收集菌体，加入含有10％甘油的磷酸盐缓冲液；
11、步骤5)在冰浴条件下超声波破碎步骤4)得到的菌体细胞，离心，提取上清液，得到重组蛋白；
12、步骤6)使用镍亲和层析柱纯化步骤5)得到的重组蛋白，低温保存；经冷冻真空干燥制成干粉，于阴凉干燥处密封保存，即得。
13、优选地，步骤1)所述重组载体的制备方法具体如下：将大丽轮枝菌n85基因的cdna片段用限制性内切酶ecori和bamhi双酶切后，连接入同样经限制性内切酶ecori和bamhi酶切后的pet-28a表达载体中，即得。
14、上述的病原菌糖基化修饰缺陷蛋白或上述制备方法制得的病原菌糖基化修饰缺陷蛋白在防治黄萎病中的应用。
15、6优选地，将所述病原菌糖基化修饰缺陷蛋白配制成水溶液喷洒到植物的叶片和根部，进行黄萎病害防治。
16、优选地，所述水溶液中蛋白的浓度为1.5g/l。
17、优选地，所述植物为棉花。
18、一种棉花黄萎病防治剂，包括上述的病原菌糖基化修饰缺陷蛋白或上述制备方法制得的病原菌糖基化修饰缺陷蛋白。
19、本专利技术的原理如下：
20、本专利技术从分子水平寻找防治黄萎病的互作靶标—效应因子(抑制植物免疫反应，大多具有糖基化修饰)，获得一个能够抑制宿主免疫的n85基因，该基因即负责抑制植物坏死免疫反应的效应因子，这对大丽轮枝菌成功入侵宿主起到重要作用。然后通过生物信息学和质谱分析的方法，发现n85基因有162n&164n两个天冬酰胺n-糖基化修饰位点对生物学功能起到至关重要的作用，糖基化修饰缺陷突变体蛋白能够被宿主识别，引起局部细胞坏死，从而阻断病原菌入侵。由此启发专利技术人通过基因工程的方法实现本专利技术的技术方案。
21、本专利技术的有益效果如下：
22、本专利技术利用大肠杆菌这种成熟的原核表达系统体外表达缺失糖基化修饰的黄萎病病原真菌效应因子蛋白，该重组蛋白因缺失天冬酰胺n-糖基化修饰而丧失抑制植物防卫反应的功能，并可被植物nbs-lrr(专一识别病原菌效应因子的膜受体蛋白)识别，激活转录与抗病相关的基因，快速阻断病原菌入侵，可有效防治由大丽轮枝菌引起的黄萎病。产物蛋白无毒，无残留，对环境友好，通过冷冻干燥的方法制成干粉制剂，蛋白质活性高且保留时间长，方便运输，用水配制成工作浓度，操作简单且易吸收。
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1.一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白，其特征在于，所述病原菌为大丽轮枝菌，所述蛋白为大丽轮枝菌N85基因在原核表达系统中表达的天冬酰胺N-糖基化修饰缺陷的重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白，其特征在于，所述原核表达系统为大肠杆菌系统。
3.权利要求2所述的一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1)所述重组载体的制备方法具体如下：将大丽轮枝菌N85基因的cDNA片段用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切后，连接入同样经限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切后的pET-28a表达载体中，即得。
5.如权利要求1或2所述的病原菌糖基化修饰缺陷蛋白或如权利要求3或4所述制备方法制得的病原菌糖基化修饰缺陷蛋白在防治黄萎病中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述病原菌糖基化修饰缺陷蛋白配制成水溶液喷洒到植物的叶片和根部，进行黄萎病害防治。
7.根据权利要求6所述的
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为棉花。
9.一种棉花黄萎病防治剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的病原菌糖基化修饰缺陷蛋白或如权利要求3或4所述制备方法制得的病原菌糖基化修饰缺陷蛋白。
...【技术特征摘要】
1.一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白，其特征在于，所述病原菌为大丽轮枝菌，所述蛋白为大丽轮枝菌n85基因在原核表达系统中表达的天冬酰胺n-糖基化修饰缺陷的重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白，其特征在于，所述原核表达系统为大肠杆菌系统。
3.权利要求2所述的一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种病原菌糖基化修饰缺陷蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1)所述重组载体的制备方法具体如下：将大丽轮枝菌n85基因的cdna片段用限制性内切酶ecori和bamhi双酶切后，连接入同样经限制性内切酶ecori和bamhi酶切后的pet...
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