【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及改造成识别甲氧基修饰的dna聚合酶突变体的方法，更具体改造成具有c2’-ome-dna合成活性的dna聚合酶突变体的方法及所制备的具有c2’-ome-dna合成活性的dna聚合酶突变体及其应用。
技术介绍
1、在自然界中生物体利用dna或者rna作为遗传信息的载体，而dna聚合酶承担遗传信息的流通的功能。随着对dna或者rna研究的深入，dna或者rna被用于分子生物学、医学等领域中，成为医学检测以及疾病治疗的有力工具。
2、但是，天然存在的dna或者rna极易被核酸酶降解，这大大阻碍了其进一步的应用。研究表明，对dna或者rna的糖环进行修饰能够极大提高对核酸酶的抵抗，c2’-ome修饰是比较常见的修饰。c2’-ome-dna表现出优良的稳定性，这在疾病治疗以及成为生物材料等应用上具有巨大的优势。然而，c2’-ome-dna难以被天然dna聚合酶识别，因此，c2’-ome-dna的转录及其逆转录也难以进行。通过对天然dna聚合酶进行改造使其具有识别c2’-ome修饰的活性是当下研究的热点。
技术实现思路
1、目前，根据氨基酸序列相似性将dna聚合酶分为7个家族。分别为a、b、c、d、x、y、rt家族(kuznetsova aa,fedorova o s,kuznetsov n a.structural and molecularkinetic features of activities of dna polymerases[j].in
2、在该方案中是将作为空间门的氨基酸残基突变为小侧链的氨基酸残基，该方案所针对的dna聚合酶家族涉及c、d、y、rt dna聚合酶家族，并且本专利技术随机挑选上述四个家族的dna聚合酶的一个成员进行了验证，分别挑选的是c家族的polc(来源：geobacilluskaustophilus)、d家族的pold(来源：pyrococcus abyssi)、y家族的dpo4(来源：saccharolobus solfataricus)以及rt家族的hiv-1 rt(来源：human immunodeficiencyvirus type 1group m subtype b)。
3、目前对于空间门的分析是基于dna聚合酶的结构来判定的，分析方法如图1。空间门氨基酸位于c2’位置处(见图1)。c2’指的是核苷酸糖环上的2号碳。突变体的原理是将具有大侧链的空间门氨基酸突变成小侧链的氨基酸，这样小侧链的氨基酸就不会对c2’-ome基团产生阻碍。在c2’附近都含有空间门氨基酸，通过突变这个空间门氨基酸就能够识别c2’-ome修饰的核苷酸。
4、为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
5、一方面，本专利技术提供改造成具有c2’-ome-dna合成活性的dna聚合酶突变体的方法，所述方法包括如下步骤：
6、a.通过结构分析，在进入dna聚合酶内部的核苷酸c2’位点附近寻找最近位置的氨基酸残基，所述氨基酸残基为具有较大侧链的氨基酸残基，例如组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸；
7、b.将dna聚合酶的所述具有较大侧链的氨基酸残基突变为具有较小侧链的氨基酸残基，所述具有较小侧链的氨基酸残基例如为甘氨酸、丙氨酸，从而获得dna聚合酶突变体。
8、在一些实施方案中，所述结构分析是对所述核苷酸和所述dna聚合酶的空间结构进行分析。
9、在一些实施方案中，所述核苷酸和所述dna聚合酶的空间结构通过查阅文献获得，例如vaisman a,ling h,woodgate r,et al.fidelity of dpo4:effect of metal ions,nucleotide selection and pyrophosphorolysis[j].the embo journal,2005,24(17):2957-67；evans r j,daviesd r,bullard j m,et al.structure of polc revealsunique dna binding and fidelity determinants[j].proc natl acad sci u s a,2008,105(52):20695-700；madru c,henneke g,raia p,et al.structural basis forthe increased processivity of d-family dna polymerases in complex with pcna[j].nat commun,2020,11(1):1591；huang h,chopra r,verdine g l,et al.structureof a covalently trapped catalytic complex of hiv-1reverse transcriptase:implications for drug resistance[j].science,1998,282(5394):1669-75。
10、在一些实施方案中，所述核苷酸和所述dna聚合酶的空间结构通过x射线晶体衍射或者冷冻电镜获得。
11、另一方面，本专利技术提供通过如上所述的方法获得的dna聚合酶突变体。
12、在一些实施方案中，所述dna聚合酶突变体选自以下项：
13、a.c家族dna聚合酶突变体，其氨基酸序列如seq id no:1所示；...
【技术保护点】
1.改造成具有C2’-OMe-DNA合成活性的DNA聚合酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.DNA聚合酶突变体，其通过根据权利要求1所述的方法获得。
3.根据权利要求2所述的DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述DNA聚合酶突变体选自以下项：
4.根据权利要求2或3所述的DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述DNA聚合酶突变体选自以下项：
5.组合物，其包含根据权利要求2-4中任一项所述的DNA聚合酶突变体。
6.多核苷酸，其编码根据权利要求2或3所述所述DNA聚合酶突变体。
7.表达载体，其表达根据权利要求2或3所述的DNA聚合酶突变体。
8.宿主细胞，其表达根据权利要求2或3所述的DNA聚合酶突变体，所述宿主细胞优选为原核细胞，更优选大肠杆菌感受态细胞E.coilBL21。
9.试剂盒，其包含根据权利要求2-4中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体。
10.PCR扩增方法，其包括使用根据权利要求2-4中任一项所述的DNA聚合酶突变体或根据权利要求9所述
...【技术特征摘要】
1.改造成具有c2’-ome-dna合成活性的dna聚合酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.dna聚合酶突变体，其通过根据权利要求1所述的方法获得。
3.根据权利要求2所述的dna聚合酶突变体，其特征在于，所述dna聚合酶突变体选自以下项：
4.根据权利要求2或3所述的dna聚合酶突变体，其特征在于，所述dna聚合酶突变体选自以下项：
5.组合物，其包含根据权利要求2-4中任一项所述的dna聚合酶突变体。
6.多核苷酸，其编码...
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