【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、本领域需要一种合成核酸的方法，它能显著降低与亚磷酰胺介导的化学合成相关的错误率和有机废物的产生。此外，本领域需要以显著降低的成本合成核酸。本文描述了使用完全天然的核酸源合成任何核酸(na)序列而不需要大规模亚磷酰胺介导的化学合成的物质组合物和方法。
技术实现思路
1、本公开提供了一种或多种addamer，其中每种addamer携带至少三个碱基对(bp)的有效载荷。全套3-聚体供体或受体addamer设计包括所有64种3-聚体bp可能性作为有效载荷。其他实施方案具有类似的发夹设计，有效载荷的长度增加。有效载荷为三时，存在64种可能的addamer。有效载荷为4bp时，在给定的文库中存在256种可能的addamer。同样，对于5-聚体有效载荷，存在1,024个元素，并且对于6-聚体有效载荷，存在4,096个元素。由于addamer是双链的，通过放置各种设计特征，对于给定的文库，使用比所有可能的n-聚体最大值少的n-聚体是可能的，并且仍然实现完整的序列覆盖。
2、addamer可包含几个碱基的发夹弯和一段短序列，其可用于指导用内切核酸酶从发夹区裂解有效载荷。此外，为了便于附着到固体支持物上，发夹区可以包含几种可能的特定结构序列中的任一种，诸如：用于亲和纯化或附着的适体序列；用于受控自动裂解的酶序列(脱氧核酶(dnazyme))；嵌套的内切核酸酶识别位点以用于通过粘性末端附着到固体支持物；或通过杂交固体支持物结合的锚序列附着的不成对的单链区域。
3、
4、在一个实施方案中，独特的受体和供体起始有效载荷的阵列通过3-聚体addamer的顺序附着产生。最初，在负载阶段，用合适的限制性内切核酸酶(re)(诸如bamhi)消化已经预先负载有携带‘附着螺柱’的双链多克隆位点(mcs)的不同固体表面。类似地，第一3-聚体addamer是re消化的并附着到‘附着螺柱’。在外切核酸酶处理和冲洗后，用适当的平切iisre消化附着的addamer构建体，从而产生平端，或者是末端带有暴露的3-聚体序列的附着的addamer(受体)，或者是末端带有暴露的3-聚体的游离平端addamer(供体)。将含供体addamer的溶液转移至所需的含受体addamer的孔中，并且使用人dna连接酶iii(hlig3)将两种addamer平接在一起，其对于平接具有>60％的高效率。在连接后，将外切核酸酶施加到孔中以去除未反应的位点并冲洗孔。在这一点上，所述孔含有携带六聚体有效载荷的固体支持物结合的addamer(参见图8)。然后，可以通过施加适当的iisre来组合六聚体有效载荷以产生受体和供体版本。然后将供体溶液施加到受体孔中并通过粘性末端连接以产生延长的有效载荷，然后对其进行外切核酸酶处理和漂洗，从而留下所需的中间有效载荷。重复这个反应循环，并且增加有效载荷长度，直到产生所需na序列的有效载荷(参见图8)。
5、本公开提供了addamer文库，其包含64种可能的3-聚体、256种可能的4-聚体、1,024种可能的5-聚体或4,096种可能的6-聚体有效载荷，其具有以下特征：a)d双链双发夹总体结构；和b)允许产生0bp、1bp、2bp、3bp、4bp或5bp突出端的独特的左侧和右侧ii型s限制性内切核酸酶(re)位点。
6、在一些方面，发夹区可以包含诸如适体的结构特征，其可以用于通过适体配体的分子亲和力将addamer固定到固体支持物上。在一些方面，发夹区可以包含用于限制性内切核酸酶裂解的限制性内切核酸酶位点以允许addamer连接到先前固定到固体支持物的核酸。在一些方面，发夹区可以包含λ噬菌体cos位点，其可以被λ终止酶裂解以允许addamer连接到先前固定到固体支持物的核酸上。在一些方面，发夹区可以包含可以与先前固定到固体支持物的核酸杂交的单链区域。
7、本公开提供了在限制性内切核酸酶裂解和随后的连接之后由addamer的组合衍生的核酸序列。
8、本公开提供了具有5’末端修饰以附着到固体支持物的双链dna锚序列，其含有多克隆位点、发夹结构和修饰的抗外切核酸酶的3’末端。
9、本公开提供了具有5’末端修饰以附着到固体支持物的单链dna锚序列，其含有与合适的addamer序列互补的序列和修饰的抗外切核酸酶的3’末端。
10、本公开提供了一种用于产生addamer文库的方法，其包括：a)设计文库元件，包括发夹、ii型s限制性内切核酸酶位点、有效载荷、其他限制性内切核酸酶位点和用于插入物切除的靶位点的序列和位置；b)将文库的每个不同addamer元件克隆到高拷贝数质粒中，作为单个拷贝或多个拷贝插入物；c)纯化每个质粒或噬细菌体dna；d)使用以下中的至少一种切除插入物：i)切口酶；ii)具有合适指导rna的cas9切口酶；和iii)反式或顺式作用的脱氧核酶；e)连接插入物以产生addamer结构；和f)任选地，进行处理以纯化addamer。
11、本公开提供了一种用于产生addamer文库的方法，其包括：a)设计文库元件，包括发夹、ii型s限制性内切核酸酶位点、有效载荷、其他限制性内切核酸酶位点和用于插入物切除的靶位点的序列和位置；b)进行特定addamer的单独的顶部和底部链的亚磷酰胺合成；c)任选地用muts或类似的纠错酶处理前addamer双链体；d)使特定addamer的顶部和底部链与连接酶接触以产生addamer结构；和e)用外切核酸酶处理步骤(d)的产物以纯化功能性addamer。
12、本公开提供了一种用于将一种或多种addamer附着到固体支持物的方法，其包括：a)将含有5’修饰的双链锚序列负载到固体表面上；b)进行锚序列的噬细菌体λ终止酶消化；c)进行一种或多种addamer的噬细菌体λ终止酶消化；d)将消化的一种或多种addamer与消化的锚序列一起孵育；和e)连接消化的一种或多种addamer和消化的锚序列。
13、本公开提供了一种用于将一种或多种addamer附着到固体支持物的方法，其包括：a)将含有5’修饰的双链锚序列负载到固体表面上；b)进行锚序列的限制性内切核酸酶消化；c)进行一种或多种addamer的限制性内切核酸酶消化；d)孵育消化的一种或多种addamer和消化的锚序列；连接消化的一种或多种addamer和消化的锚序列。
14、本公开提供本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双链Addamer，其中所述Addamer包含：
2.如权利要求1所述的Addamer，其中所述Addamer在所述Addamer的两端包含发夹结构。
3.如前述权利要求中任一项所述的Addamer，其中所述Addamer包含：
4.如前述权利要求中任一项所述的Addamer，其中所述Addamer包含：
5.如前述权利要求中任一项所述的Addamer，其中所述Addamer还包含多克隆位点(MCS)序列，其中所述MCS序列包含一个或多个限制性内切核酸酶序列。
6.如前述权利要求中任一项所述的Addamer，其中所述IISRE序列中的至少一个选自MlyI序列、NgoAVII序列、SspD5I序列、AlwI序列、BccI序列、BcefI序列、PleI序列、BceAI序列、BceSIV序列、BscAI序列、BspD6I序列、FauI序列、EarI序列、BspQI序列、BfuAI序列、PaqCI序列、Esp3I序列、BbsI序列、BbvI序列、BtgZI序列、FokI序列、BsmFI序列、BsaI序列、BcoDI序列和
7.如前述权利要求中任一项所述的Addamer，其中至少一个发夹结构包含适体序列。
8.如权利要求7所述的Addamer，其中所述适体序列选自pL1适体序列、凝血酶29-聚体适体序列、S2.2适体序列、ART1172适体序列、R12.45适体序列、Rb008适体序列和38NTSELEX适体序列。
9.一种组合物，其包含固定到固体支持物的如前述权利要求中任一项所述的Addamer。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述固体支持物是珠。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述珠包含聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、琼脂糖或它们的任何组合。
12.如权利要求9所述的组合物，其中所述固体支持物是孔或室的表面。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述孔或室是多孔板的部分。
14.如权利要求9至13中任一项所述的组合物，其中
15.如权利要求9至13中任一项所述的组合物，其中
16.如权利要求9至13中任一项所述的组合物，其中
17.一种产生如权利要求1至8中任一项所述的Addamer的方法，所述方法包括：
18.如权利要求17所述的方法，其还包括用外切核酸酶处理步骤(c)的产物，从而纯化正确连接的Addamer。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其还包括在步骤(b)之后和在步骤(c)之前，使所述部分双链核酸分子与MutS酶接触。
20.一种产生如权利要求1至8中任一项所述的Addamer的方法，所述方法包括：
21.如权利要求20所述的方法，其还包括用外切核酸酶处理步骤(f)的产物，从而纯化正确连接的Addamer。
22.一种产生如权利要求1至8中任一项所述的Addamer的方法，所述方法包括：
23.一种合成包含靶核酸序列的核酸分子的方法，所述方法包括：
24.如权利要求23所述的方法，其中所述连接酶是人DNA连接酶III(hLig3)。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述连接酶是T4 DNA连接酶。
26.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述靶核酸序列的长度为至少约100个、或至少约500个、或至少约1000个、或至少约2000个、或至少约3000个、或至少约4000个、或至少约5000个核苷酸。
27.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中包含所述靶核酸序列的合成核酸分子具有至少80％的纯度。
28.如权利要求23至27中任一项所述的方法，其中包含所述靶核酸序列的所述合成核酸分子具有至少90百分之的纯度。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种双链addamer，其中所述addamer包含：
2.如权利要求1所述的addamer，其中所述addamer在所述addamer的两端包含发夹结构。
3.如前述权利要求中任一项所述的addamer，其中所述addamer包含：
4.如前述权利要求中任一项所述的addamer，其中所述addamer包含：
5.如前述权利要求中任一项所述的addamer，其中所述addamer还包含多克隆位点(mcs)序列，其中所述mcs序列包含一个或多个限制性内切核酸酶序列。
6.如前述权利要求中任一项所述的addamer，其中所述iisre序列中的至少一个选自mlyi序列、ngoavii序列、sspd5i序列、alwi序列、bcci序列、bcefi序列、plei序列、bceai序列、bcesiv序列、bscai序列、bspd6i序列、faui序列、eari序列、bspqi序列、bfuai序列、paqci序列、esp3i序列、bbsi序列、bbvi序列、btgzi序列、foki序列、bsmfi序列、bsai序列、bcodi序列和hgai序列。
7.如前述权利要求中任一项所述的addamer，其中至少一个发夹结构包含适体序列。
8.如权利要求7所述的addamer，其中所述适体序列选自pl1适体序列、凝血酶29-聚体适体序列、s2.2适体序列、art1172适体序列、r12.45适体序列、rb008适体序列和38ntselex适体序列。
9.一种组合物，其包含固定到固体支持物的如前述权利要求中任一项所述的addamer。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述固体支持物是珠。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述珠包含聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、琼脂糖或它们的任何组合。
12.如权利要求9所述的组合物，其中所述固体支持物是孔或...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·斯泰姆普勒，S·曼考斯卡，N·贝尔，
申请(专利权)人：卡美纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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