【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于干细胞和动物细胞培养肉，具体涉及一种肌卫星细胞和脂肪干细胞共培养及定向分化诱导的方法。
技术介绍
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技术介绍
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1、传统肉类生产面临着资源短缺、环境污染和动物福利等问题，因此人工培养肉的研究成为解决这些问题的重要途径之一。大黄鱼作为一种优质的食用鱼类，其肉质鲜美，且富含蛋白质和脂肪，非常适合用于细胞培养肉的生产。
2、肌卫星细胞是肌肉组织中具有增殖和自我更新能力的成肌前体细胞或单能成肌干细胞，具有良好的分化潜能，可以发展为功能性肌肉细胞。而脂肪来源干细胞则具有较强的成脂分化能力，可以为培养肉提供更好的质地和口感。因此，将大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞进行共培养，并实现其定向分化诱导，是提高培养肉品质和口感的关键。
3、然而，目前的培养方法多是肌肉组织和脂肪组织分别培养以及分化，但现实中的动物肉多是肌肉和脂肪组织混合，所以单培养的方式得到的产品距离真实动物肉的口感还有一定距离。尚缺乏一种有效的方法，能够实现大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞的共培养和定向分化诱导。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术要解决的技术问题是在细胞培养肉的研究中尚缺乏一种有效的方法，能够实现大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞的共培养和定向分化诱导。
2、为解决上述问题，本专利技术提供了一种肌卫星细胞和脂肪干细胞共培养及定向分化诱导的方法，能够有效地共培养大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞，并实现其共同定向分化诱导，从而为大
3、为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现，一种肌卫星细胞和脂肪干细胞共培养及定向分化诱导的方法，包括以下步骤：
4、(1)共培养：将大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞使用大黄鱼完全培养基重悬，按任意比例混合，铺板，置于26-30℃的生化培养箱中培养，培养基每两天换一次；
5、(2)共分化：待步骤(1)中共培养的大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞长至密度90％以上，移除大黄鱼干细胞培养基，加入大黄鱼成脂分化培养基进行分化7-21天，隔天换液，随后再加入大黄鱼成肌分化培养基进行成肌分化4-6天，共分化共持续11-27天。先进行诱导成脂分化的原因是，成脂分化培养基在诱导大黄鱼脂肪来源干细胞成脂分化的同时，可维持大黄鱼肌卫星细胞的基本生长条件，诱导成脂分化后再进行诱导成肌分化，可使大黄鱼肌卫星细胞进行成肌分化，而对大黄鱼脂肪来源干细胞的成脂分化进程无明显影响，因此此过程可实现大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞在同一环境中诱导各向分化。
6、进一步的，步骤(1)中的大黄鱼完全培养基为90％dmem/f12基础培养基+10％胎牛血清。该完全培养基可同时满足大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞正常生长的营养需求。
7、进一步的，步骤(2)中大黄鱼成脂分化培养基为90％dmem/f12基础培养基+10％胎牛血清，在此基础上添加成脂诱导因子：胰岛素浓度为1-10mg/l，地塞米松浓度为0.5-5μmol/l，罗格列酮浓度为2-20μmol/l，吲哚美辛浓度为10-100μmol/l，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤浓度为0.05-1mmol/l，花生四烯酸浓度为1-20μg/ml，胆固醇浓度为110-2200μg/l，生育酚醋酸酯浓度为35-700μg/l，油酸浓度为5-100μg/l，亚油酸浓度为5-100μg/l，棕榈酸浓度为5-100μg/l，硬脂酸浓度为5-100μg/l，亚麻酸浓度为5-100μg/l，肉豆蔻酸浓度为5-100μg/l。
8、其中，花生四烯酸：花生四烯酸是一种多不饱和脂肪酸，参与调控脂肪细胞的生长和发育。它是合成一系列促进脂肪细胞增殖和分化的信号分子，可以影响脂肪细胞的数量和大小。
9、胆固醇：胆固醇是一种重要的脂质组分，在脂肪细胞的成脂分化中起关键作用。胆固醇可以促进脂肪细胞的形成，并参与细胞膜的建立和稳定。
10、生育酚醋酸酯：生育酚醋酸酯是维生素e的一种形式，具有抗氧化和抗炎作用。它可以保护脂肪细胞免受氧化应激的损伤，同时促进脂肪细胞的分化和功能成熟。
11、油酸：油酸是一种单不饱和脂肪酸，常见于植物油和动物脂肪中。在脂肪细胞的成脂分化中，油酸参与三酰甘油的合成和储存，同时影响脂肪细胞的代谢和功能。
12、亚油酸：亚油酸是一种多不饱和脂肪酸，是人体必需脂肪酸之一。在脂肪细胞的成脂分化中，亚油酸参与细胞膜的构建和稳定，并调节脂肪细胞的生长和发育。
13、棕榈酸：棕榈酸是一种饱和脂肪酸，常见于天然油脂中。它参与调控脂肪细胞的分化和代谢，影响脂肪酸合成、脂肪细胞大小和数量的调节。
14、硬脂酸：硬脂酸是一种饱和脂肪酸，常见于动物脂肪中。它在脂肪细胞的成脂过程中参与三酰甘油的合成和储存，同时影响脂肪细胞的代谢和功能。
15、亚麻酸：亚麻酸是一种多不饱和脂肪酸，是人体必需脂肪酸之一。它在脂肪细胞的成脂分化中调节细胞膜的流动性和稳定性，促进细胞的分化和发育。
16、肉豆蔻酸：肉豆蔻酸是一种饱和脂肪酸，存在于植物油和动物脂肪中。它参与脂肪细胞的分化和成熟，影响细胞大小、代谢和功能。
17、进一步的，步骤(2)中大黄鱼成肌分化培养基为98％dmem/f12基础培养基+2％马血清，在此基础上添加成肌诱导因子：维生素d的浓度为10-300ng/ml。
18、进一步的，所述的大黄鱼干细胞完全培养基和成脂分化培养基中还添加有抗生素。作为实施例的一种具体记载，是添加1.0×105u/l青霉素钠，100mg/l链霉素和2.5mg/l两性霉素b。
19、进一步的，步骤(1)中的大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞的分离方法包括以下步骤：
20、(0-1)取大黄鱼肌肉组织或脂肪组织，剪碎，加入消化液消化0.2-3h，向消化好的组织混合液加入洗涤液，洗涤后过滤得到细胞悬液，在800-2000rpm/min条件下离心5-10min收集细胞，再加入洗涤液洗涤和离心收集细胞；
21、其中肌肉组织或脂肪组织与消化液的比例可在1：1～1:10之间，肌肉组织或脂肪组织与洗涤液的比例可在1：1～1:10之间，消化液的配方为0.1-1mg/ml的ⅰ型胶原酶和0.05-1mg/ml的胰蛋白酶，洗涤液为d-hanks液；
22、(0-2)如观察到细胞离心团块中有明显可见的红细胞，则进行裂解红细胞处理；如观察到细胞离心团块中无明显可见的红细胞，则直接进行下一步；
23、(0-3)用大黄鱼干细胞完全培养基重悬细胞得到细胞悬液，接种到6孔细胞培养板中，培养3h后，转移到新孔中，补充大黄鱼干细胞完全培养基至3ml，随后放置到28℃条件下培养；待细胞生长汇集至85％-90％即可对其进行传代。
24、进一步的，上述传代步骤为：弃去旧培养基，加入1-3ml pbs清洗细胞1-2遍，去除残余血清，加入100-300本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肌卫星细胞和脂肪干细胞共培养及定向分化诱导的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)共培养：将大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞使用大黄鱼完全培养基重悬，按任意比例混合，铺板，置于26-30℃的生化培养箱中培养，培养基每两天换一次；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的大黄鱼完全培养基为90％DMEM/F12基础培养基+10％胎牛血清。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中大黄鱼成脂分化培养基为90％DMEM/F12基础培养基+10％胎牛血清，在此基础上添加成脂诱导因子：胰岛素浓度为1-10mg/L，地塞米松浓度为0.5-5μmol/L，罗格列酮浓度为2-20μmol/L，吲哚美辛浓度为10-100μmol/L，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤浓度为0.05-1mmol/L，花生四烯酸浓度为1-20μg/mL，胆固醇浓度为110-2200μg/L，生育酚醋酸酯浓度为35-700μg/L，油酸浓度为5-100μg/L，亚油酸浓度为5-100μg/L，棕榈酸浓度为5-100μg/L，硬脂酸浓度为5-100μg/L，亚麻酸浓度为5-
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中大黄鱼成肌分化培养基为98％DMEM/F12基础培养基+2％马血清，在此基础上添加成肌诱导因子：维生素D的浓度为10-300ng/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的大黄鱼干细胞完全培养基和成脂分化培养基中还添加有抗生素。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞的分离方法包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(0-1)中肌肉组织或脂肪组织与消化液的比例可在1：1～1:10之间，肌肉组织或脂肪组织与洗涤液的比例可在1：1～1:10之间，消化液的配方为0.1-1mg/mL的Ⅰ型胶原酶和0.05-1mg/mL的胰蛋白酶，洗涤液为D-hanks液。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：传代步骤为：弃去旧培养基，加入1-3mlPBS清洗细胞1-2遍，去除残余血清，加入100-300μL 0.25％胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察细胞呈圆球状，轻拍可致大部分细胞脱落时即可停止消化，加入1ml DMEM/F12完全培养基停止消化，再加入2ml完全培养基重悬细胞，轻柔吹打数次成细胞悬液，按1:2或1:3比例分装至新T25培养瓶中，补充每瓶培养基体系至5ml。封口、标记后放入28℃的生化培养箱中培养。
...【技术特征摘要】
1.一种肌卫星细胞和脂肪干细胞共培养及定向分化诱导的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)共培养：将大黄鱼肌卫星细胞和脂肪来源干细胞使用大黄鱼完全培养基重悬，按任意比例混合，铺板，置于26-30℃的生化培养箱中培养，培养基每两天换一次；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的大黄鱼完全培养基为90％dmem/f12基础培养基+10％胎牛血清。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中大黄鱼成脂分化培养基为90％dmem/f12基础培养基+10％胎牛血清，在此基础上添加成脂诱导因子：胰岛素浓度为1-10mg/l，地塞米松浓度为0.5-5μmol/l，罗格列酮浓度为2-20μmol/l，吲哚美辛浓度为10-100μmol/l，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤浓度为0.05-1mmol/l，花生四烯酸浓度为1-20μg/ml，胆固醇浓度为110-2200μg/l，生育酚醋酸酯浓度为35-700μg/l，油酸浓度为5-100μg/l，亚油酸浓度为5-100μg/l，棕榈酸浓度为5-100μg/l，硬脂酸浓度为5-100μg/l，亚麻酸浓度为5-100μg/l，肉豆蔻酸浓度为5-100μg/l。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中大黄鱼成肌分化...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛长湖，周旋，郑洪伟，魏迎新，殷浩文，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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