本发明专利技术公开PVA/Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;/GO纳米复合材料、制备方法及基于协同抑冰效应的卵母细胞低温保存方法。该复合纳米材料通过氢键以及静电作用将聚乙烯醇、四氧化三铁与氧化石墨烯三者复合；能够在冷冻过程降低溶液过冷度，抑制尖锐冰晶形貌的产生；在溶液复温阶段，能抑制冰晶发生再结晶，在外界激光与交变磁场的作用下能对溶液实现快速升温，减弱复温阶段溶液内部热应力与反玻璃化现象的产生。本发明专利技术利用该纳米复合材料和单一、低浓度渗透性保护剂实现卵母细胞的批量冻存；利用纳米复合材料辅助方式冷冻的卵母细胞复苏后存活效率更高，并且相比于传统方法变化的基因数目更少。通过该冻存方法复苏后的卵母细胞，能实现正常受精、发育及体内移植后生出健康的小鼠子代。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米复合材料、生育力保存以及再生医学等，具体涉及pva/fe3o4/go纳米复合材料、制备方法及基于协同抑冰效应的卵母细胞低温保存方法。
技术介绍
1、近年来，由于各种疾病或者个人原因造成的女性生育力丧失愈发普遍。特别是，由于癌症疾病在低年龄段女性的高发更是日渐严重。在女性患者接受放疗、化疗以及手术等治疗手段后，极易造成患者卵巢功能遭受影响，丧失生殖能力，因此在接受相应治疗手段之前进行生育力保存至关重要。此外，当前诸多女性由于个人或者社会因素倾向于推迟生育年龄，所以提前对其生育力进行有效地保存在这一女性群体中也具有广泛需求。
2、当前，对女性的胚胎和成熟卵母细胞进行低温保存是被美国生殖医学会所批准的唯一手段。而这其中，由于卵母细胞获取相对容易以及不易引发伦理问题等诸多优势在临床中被广泛作为女性生育力保存的方法。目前，利用玻璃化冷冻保存方法是实现卵母细胞冷冻保存的主要方法。利用玻璃化冻存，可以实现在冷冻阶段没有冰晶形成，降低对卵母细胞的冰晶损伤，但这一目标的实现需要添加高浓度的cpa以及对单个卵母细胞直接冷冻，目前传统方法是添加4.3m的cpa以及利用一种cryotop装置单次只能冷冻一个卵母细胞。
3、因此，传统玻璃化冷冻的方式不仅由于高浓度cpa对卵母细胞引起了严重的化学毒性损伤，同时单次的冻存通量也受到了严重限制。因此，如何能够实现在低浓度cpa同时保证对卵母细胞进行高效的批量冻存，是当前女性生育力保存领域亟需解决的科学难题。
技术实现思路
>1、考虑到以上问题，本专利技术提出了一种pva/fe3o4/go纳米复合材料、制备方法及基于协同抑冰效应的卵母细胞低温保存方法。所述纳米复合材料为具有在冷冻及复温阶段兼具抑冰效应的纳米复合材料，该复合材料可以同时抑制冰晶尖锐形貌产生、冰晶再结晶现象以及反玻璃化损伤，在其辅助下可实现低浓度cpa下对卵母细胞的批量冻存，为女性生育力的高效保存提供了一条全新的路径。2、为了实现上述目的，本专利技术通过如下技术方案实现。
3、一种pva/fe3o4/go纳米复合材料的制备方法，首先将聚乙烯醇(pva)通过氢键作用包裹在fe3o4周围，形成pva/fe3o4纳米球；然后将pva/fe3o4纳米球再通过静电吸附作用连接在氧化石墨烯(go)表面，最后形成平均粒径为百纳米(300-700nm)尺寸的pva/fe3o4/go纳米复合材料，所述pva/fe3o4/go纳米复合材料在冷冻及复温阶段兼具抑冰效应。优选地，pva/fe3o4纳米球的平均粒径为10～50nm。例如，pva/fe3o4纳米球的平均粒径为10nm、12nm、14nm、16nm、18nm、20nm、22nm、24nm、26nm、28nm、30nm、35nm、40nm、45nm或50nm。
4、进一步地，所述方法包括以下步骤：
5、(1)制备fe3o4；
6、(2)将聚乙烯醇与fe3o4混合，在60～90℃水浴温度下进行超声混合，离心洗涤，得到fe3o4/pva复合材料；
7、(3)将fe3o4/pva复合材料、氧化石墨烯和去离子水混合，离心洗涤，真空干燥，得到fe3o4/pva/go。
8、进一步地，步骤(1)中，所述fe3o4的平均粒径为10～30nm；例如，fe3o4的平均粒径为10nm、12nm、14nm、16nm、18nm、20nm、22nm、24nm、26nm、28nm或30nm。
9、优选地，步骤(2)中，聚乙烯醇与fe3o4的质量比为100～250：80～120；例如，聚乙烯醇与fe3o4的质量比为100：80～120、102：80～120、105：80～120、110：80～120、115：80～120、120：80～120、125：80～120、130：80～120、135：80～120、140：80～120、145：80～120、150：80～120、160：80～120、170：80～120、180：80～120、190：80～120、200：80～120、210：80～120、220：80～120、230：80～120、240：80～120或250：80～120。
10、优选地，步骤(3)中，fe3o4/pva复合材料和氧化石墨烯的质量比为100～200：200～400。例如，fe3o4/pva复合材料和氧化石墨烯的质量比为100：200～400、105：200～400、110：200～400、120：200～400、130：200～400、140：200～400、150：200～400、160：200～400、170：200～400、180：200～400、190：200～400或200：200～400。
11、优选地，步骤(3)中，氧化石墨烯和去离子水的比为200～500mg：40ml；例如，氧化石墨烯和去离子水的比为200mg：40ml、250mg：40ml、300mg：40ml、350mg：40ml、400mg：40ml、450mg：40ml或500mg：40ml。
12、如上任一项所述的方法制备的pva/fe3o4/go纳米复合材料。
13、进一步地，所述的pva/fe3o4/go纳米复合材料用于卵母细胞低温保存时，与乙二醇和海藻糖配合使用。
14、本专利技术还提供一种基于协同抑冰效应的卵母细胞低温保存方法，利用如上任一所述的pva/fe3o4/go纳米复合材料，包括以下步骤：
15、(1)、将pva/fe3o4/go纳米复合材料添加到乙二醇中，得到混合液；优选地，在所述混合液中，pva/fe3o4/go纳米复合材料的浓度为1.5～2.5mg/ml；优选地，所述混合液中还含有海藻糖；
16、(2)、按照卵母细胞冻存步骤，利用步骤(1)制得的混合液对小鼠mii时期的卵母细胞进行冻存；
17、(3)、卵母细胞经过冻存后，利用激光与交变磁场对冷冻的卵母细胞进行复温；
18、(4)、通过转录组测序对复苏的卵母细胞进行基因测序，评估冷冻对其基因组的影响。
19、具体地，一种基于协同抑冰效应的卵母细胞低温保存方法，使用如上所述的pva/fe3o4/go纳米复合材料，包括以下步骤：
20、1、将2mg/ml的pva/fe3o4/go纳米复合材料添加到cpa中，此处cpa为浓度是2.5m的eg与1m的海藻糖溶液；
21、2、按照卵母细胞冻存步骤，利用含有pva/fe3o4/go纳米复合材料对小鼠mii时期的卵母细胞进行冻存；
22、3、卵母细胞经过24h的冻存后，利用激光与交变磁场对冷冻的卵母细胞进行复温；
23、4、通过转录组测序对复苏的卵母细胞进行基因测序，评估冷冻对其基因组的影响。此外，将复苏的卵母细胞进行体外受精、发育、以及移植进入代孕母鼠体内进行子代生殖，评估复苏后卵母细胞的生物学功能。
24、具本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PVA/Fe3O4/GO纳米复合材料的制备方法，其特征在于，首先将聚乙烯醇(PVA)通过氢键作用包裹在Fe3O4周围，形成PVA/Fe3O4纳米球；然后将PVA/Fe3O4纳米球再通过静电吸附作用连接在氧化石墨烯(GO)表面，最后形成平均粒径为百纳米(300–700nm)尺寸的PVA/Fe3O4/GO纳米复合材料，所述PVA/Fe3O4/GO纳米复合材料在冷冻及复温阶段兼具抑冰效应；优选地，PVA/Fe3O4纳米球的平均粒径为10～50nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述Fe3O4的平均粒径为10～30nm；
4.权利要求1-3任一项所述的方法制备的PVA/Fe3O4/GO纳米复合材料。
5.一种基于协同抑冰效应的卵母细胞低温保存方法，其特征在于，利用如权利要求4所述的PVA/Fe3O4/GO纳米复合材料，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(5)将复苏的卵母细胞进行体外受精、发育、以及移植进入代孕母鼠体内进行子代生殖，评估复苏后卵母细胞的生物学功能。
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【技术特征摘要】
1.一种pva/fe3o4/go纳米复合材料的制备方法，其特征在于，首先将聚乙烯醇(pva)通过氢键作用包裹在fe3o4周围，形成pva/fe3o4纳米球；然后将pva/fe3o4纳米球再通过静电吸附作用连接在氧化石墨烯(go)表面，最后形成平均粒径为百纳米(300–700nm)尺寸的pva/fe3o4/go纳米复合材料，所述pva/fe3o4/go纳米复合材料在冷冻及复温阶段兼具抑冰效应；优选地，pva/fe3o4纳米球的平均粒径为10～50nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：赵刚，常铁，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：
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