【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种苜蓿瞬转表达纤维素酶及其在文冠果叶片活性物质提取中的应用。
技术介绍
1、文冠果树属无患子科，是我国重要的经济作物。文冠果叶片富含蛋白质，氨基酸和多种微量元素；此外，文冠果叶片中也含有黄酮、多糖和皂苷等生物活性成分，具有较高的营养价值和生物学功效，是潜在的众多活性物质的提取原料，也是潜在的优质无抗养殖饲料添加剂。但是，文冠果叶片的活性物质主要存在于细胞质中，被细胞壁所保护。因此，文冠果叶片的利用需要将文冠果叶片细胞壁破裂，释放活性物质。目前仍然缺乏经济有效的技术去解决上述问题。
2、植物细胞壁主要具有纤维素、半纤维素、木质素、果胶和糖蛋白等成分构成。其中，纤维素、半纤维素、木质素是构成植物细胞壁的主要成分。纤维素酶的施加可以有效水解植物细胞壁的纤维组织，破坏细胞壁完整性，从而促进植物细胞内有效成分的释放。但目前纤维素酶主要通过细菌、真菌等微生物产生，需要进行较为复杂的制备和制剂工艺以及设备，也具有细菌、真菌内毒素污染等问题，在一定程度上限制了纤维素酶在植物化学领域的应用。农杆菌介导的植物基因瞬时表达技术是将目的基因插入表达载体中，将载体转化到农杆菌中，利用渗透技术使农杆菌侵染植物宿主细胞。外源基因不需要整合在植物的基因组中就可以表达，因此不需要形成稳定遗传的转基因植株即可在短期内快速表达外源基因。
3、目前，纤维素酶的表达主要使用的是细菌或真菌，例如，专利技术专利cn104404067a公开了使用乳酸杆菌表达纤维素酶，专利技术专利cn108624613a公开了使用酿酒酵母工
4、因为植物不含有内毒素，因此用植物瞬时表达纤维素酶可以解决纤维素酶中含有内毒素的技术问题，目前报道的表达纤维素酶的植物仅有烟草，然而，烟草中具有烟碱等有害物质，需要对烟草纤维素酶纯化，否则不适用于活性物质提取，从而提高了植物源纤维素酶的生产成本，同时，植物瞬时表达的纤维素酶的活性较低低，如何提高植物瞬时表达的纤维素酶活性仍然缺乏简单有效的方法。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术的首要目的在于提供一种苜蓿瞬转表达纤维素酶的方法，包括如下步骤：
2、(1)纤维素酶编码基因构建载体，转化农杆菌，培养，离心，收集细菌，用缓冲液悬浮，稀释菌液至od值为0.6-1.0；
3、(2)用步骤(1)得到的菌液对苜蓿叶片进行真空渗透，培养，用1-500μm褪黑素喷施苜蓿叶片，每天喷洒一次；
4、(3)步骤(2)得到的苜蓿叶片研磨，匀浆，离心，提取上清液，得到纤维素酶酶液。
5、优选的，步骤(2)所述的褪黑素浓度为20-500μm。
6、优选的，步骤(1)所述的农杆菌为lba4404菌株，首先在含有抗生素的yeb琼脂平板上培养出单菌落，然后将培养的单菌落接种在yeb液体培养基中培养。
7、优选的，步骤(1)所述的od值在600nm处。
8、优选的，步骤(1)所述的缓冲液为10mm硫酸镁；10mm mes-koh，ph 5.5；100μμ乙酰丁香酮。
9、优选的，步骤(2)所述的培养条件为25℃下培养4-9天。
10、优选的，步骤(3)所述的离心速度是14000rpm，时间为20分钟。
11、本专利技术的第二目的是提供所述的方法得到的纤维素酶在降解木质纤维素中的应用。
12、本专利技术的第三目的是提供一种降解植物木质纤维素提取活性成分的纤维素酶，是由所述的方法制备获得。
13、本专利技术的第四目的是提供所述的纤维素酶在提取文冠果叶片活性物质中的应用，所述的文冠果叶片活性物质包括黄酮、皂苷和多糖。
14、本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术提供了一种苜蓿叶片瞬转纤维素酶基因表达纤维素酶的方法，所述的方法在表达的过程中施加外源褪黑素，能够提高得到的纤维素酶的活性，解决了植物表达纤维素酶活性较低的技术问题；(2)所述的方法步骤简单，制备得到的纤维素酶不含有毒性物质内毒素，可以用于植物活性物质的提取；(3)通过所述的方法制备得到的纤维素酶，有效增加了文冠果叶片的活性物质的提取效率。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种苜蓿瞬转表达纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的褪黑素浓度为20-500μM。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的农杆菌为LBA4404菌株，首先在含有抗生素的YEB琼脂平板上培养出单菌落，然后将培养的单菌落接种在YEB液体培养基中培养。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的OD值在600nm处。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的缓冲液为10mM硫酸镁；10mMMES-KOH，pH 5.5；100μΜ乙酰丁香酮。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的培养条件为25℃下培养4-9天。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的离心速度是14000rpm，时间为20分钟。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法得到的纤维素酶在降解木质纤维素中的应用。
9.一种降解植物木质纤维素提取活性成分的纤维素酶，其特征在于，是由权利要
10.如权利要求9所述的纤维素酶在提取文冠果叶片活性物质中的应用，其特征在于，所述的文冠果叶片活性物质包括黄酮、皂苷和多糖。
...【技术特征摘要】
1.一种苜蓿瞬转表达纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的褪黑素浓度为20-500μm。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的农杆菌为lba4404菌株，首先在含有抗生素的yeb琼脂平板上培养出单菌落，然后将培养的单菌落接种在yeb液体培养基中培养。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的od值在600nm处。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的缓冲液为10mm硫酸镁；10mmmes-koh，ph 5.5；10...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯汉青，梁俊玉，张继，王俊龙，曹福亮，吴建平，马彦男，贾凌云，
申请(专利权)人：西北师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。