【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原微生物检测，具体涉及lamp-crispr/cas12a可视化鉴别rhdv 1型和2型的试剂盒及方法。
技术介绍
1、兔出血症是一种急性、烈性、高度接触性传染病，由兔出血症病毒（rhdv）引起，该疾病死亡率极高，严重危害养兔业的发展。相较于经典rhdv称为兔出血症病毒1型（rhdv1），毒株兔出血症病毒2型（rhdv2）宿主范围更广，传播途径多，在自然环境下抵抗力强，对养殖业造成巨大经济损失，高效、准确且能鉴别二者的诊断工具对防控兔出血症疫情尤为重要。
2、目前已有pcr、荧光定量pcr、血凝实验、elisa等检测方法。免疫学检测方法如血凝实验、elisa实验检测的准确性较差，且存在窗口期难检出等不足，病原学检测方法如rt-pcr、荧光定量pcr需要专业的仪器，一般是实验室检测，无法做到现场的快速检测，无法满足基层养殖场的检测需求。目前基于lamp和crispr-cas12a快速可视化鉴别兔出血症病毒的研究未见相关报道，且该方法应用到区分兔出血症病毒1型和兔出血症病毒2型的快速鉴别也未见相关报道。
技术实现思路
1、本专利技术提供了lamp-crispr/cas12a可视化鉴别rhdv 1型和2型的试剂盒及方法，该试剂盒和方法可精确鉴别出rhdv1和rhdv2病毒，具有快速、高灵敏、高特异、可视化和低设备要求的优势。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了lamp-crispr/cas12a
4、优选的，所述lamp扩增体系中还包括环引物lf和lb；针对rhdv1的lamp扩增体系中环引物lb的核苷酸序列如seq id no.17所示；针对rhdv2的lamp扩增体系中环引物lf和lb的核苷酸序列如seq id no.28-29所示。
5、优选的，所述lamp扩增体系中还包括lamp/rt-lamp 2x预混液、待检核酸和无酶水。
6、优选的，所述crispr/cas12a检测体系还包括lamp扩增产物、rna酶抑制剂、nebuffer 2.1、cas12a蛋白、ssdna报告分子和无酶水。
7、优选的，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。
8、本专利技术提供了所述试剂盒在制备鉴别rhdv1和rhdv2产品中的应用。
9、本专利技术提供了基于lamp-crispr/cas12a可视化鉴别rhdv1和rhdv2的非疾病诊断目的的方法，包括如下步骤：（1）提取待检测样本的rna；（2）以步骤（1）提取的rna为模板，在lamp扩增体系中进行lamp扩增；（3）将步骤（2）得到的lamp扩增产物在crispr/cas12a检测体系中酶切并进行荧光检测；或将得到的lamp扩增产物在crispr/cas12a检测体系中酶切并进行侧流层析试纸条检测。
10、优选的，所述lamp扩增体系总体积为25μl，12.5μl lamp/rt-lamp 2x预混液、2.5μl引物混合物、2μl提取的rna和8μl无酶水；针对rhdv1的lamp扩增体系中，外引物对f3和b3的终浓度分别为200nm，内引物对fip、bip的终浓度分别为1200nm，环引物lb的终浓度为600nm；针对rhdv2的lamp扩增体系中，外引物对f3和b3的终浓度分别为200nm，内引物对fip和bip的终浓度分别为800nm，环引物lf和lb的终浓度分别为600nm。
11、优选的，当进行荧光检测时，所述crispr/cas12a检测体系总体积为20μl，2μllamp扩增产物、1μl rna酶抑制剂（终浓度0.5u/μl）、2μl grna（终浓度500nm）、2μlnebuffer 2.1、1μl cas12a蛋白（终浓度125nm）、1μl荧光猝灭ssdna报告分子（终浓度250nm）和11μl无酶水。
12、优选的，当进行侧流层析试纸条检测时，所述crispr/cas12a检测总体积为20μl，2μl lamp扩增产物、1μl rna酶抑制剂（终浓度0.5u/μl）、2μl grna（终浓度500nm）、2μlnebuffer 2.1、1μl cas12a蛋白（终浓度125nm）、1μl生物素ssdna报告分子（终浓度100nm）和11μl无酶水。
13、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
14、本专利技术为了快速、便捷、特异性检测rhdv1和rhdv2病毒，建立了针对rhdv1和rhdv2的lamp-crispr/cas12a快速检测方法，该平台表现出较高的灵敏度，能够检测到10拷贝/μl的核酸样本，具有良好的特异性，能够特异性鉴别rhdv1和rhdv2型毒株，且与兔其他常见病原体无交叉反应。
15、本专利技术进一步利用侧流层析试纸条和可视化荧光，在1.5h内得到肉眼可见的结果。此外，用针对rhdv1和rhdv2的检测系统分别检测74个临床样本，与荧光定量pcr检测的符合率分别为97.30%和97.30%，敏感性高于荧光定量pcr。本专利技术制备的试剂盒和构建的检测方法具有快速、高灵敏、高特异、可视化和低设备要求的优势，可供偏远农村和资源受限地区的临床使用。
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1.基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系；
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP扩增体系中还包括环引物LF和/或LB；针对RHDV1的LAMP扩增体系中环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；针对RHDV2的LAMP扩增体系中环引物LF和LB的核苷酸序列如SEQ ID No.28-29所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP扩增体系中还包括LAMP/RT-LAMP2X预混液、待检核酸和无酶水。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测体系还包括LAMP扩增产物、RNA酶抑制剂、NEBuffer 2.1、Cas12a蛋白、ssDNA报告分子和无酶水。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。
6.如权利要求1~5任意一项所述的试剂盒在制备鉴别RHDV1和RHDV2产品中的应用。>
7.基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增体系总体积为25μL，12.5μLLAMP/RT-LAMP 2X预混液、2.5μL引物混合物、2μL提取的RNA和8μL无酶水；
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行荧光检测时，所述CRISPR/Cas12a检测体系总体积为20μL，2μL LAMP扩增产物、1μL终浓度0.5U/μL的RNA酶抑制剂、2μL终浓度500nM的gRNA、2μL NEBuffer 2.1、1μL终浓度125nM的Cas12a蛋白、1μL终浓度250nM的荧光猝灭ssDNA报告分子和11μL无酶水。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行侧流层析试纸条检测时，所述CRISPR/Cas12a检测体系总体积为25μL，2μL LAMP扩增产物、1μL终浓度0.5U/μL的RNA酶抑制剂、2μL终浓度500nM的gRNA、2μL NEBuffer 2.1、1μL终浓度125nM的Cas12a蛋白、1μL终浓度100nM的生物素ssDNA报告分子和11μL无酶水。
...【技术特征摘要】
1.基于lamp-crispr/cas12a可视化鉴别rhdv 1型和2型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括lamp扩增体系和crispr/cas12a检测体系；
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述lamp扩增体系中还包括环引物lf和/或lb；针对rhdv1的lamp扩增体系中环引物lb的核苷酸序列如seq id no.17所示；针对rhdv2的lamp扩增体系中环引物lf和lb的核苷酸序列如seq id no.28-29所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述lamp扩增体系中还包括lamp/rt-lamp2x预混液、待检核酸和无酶水。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crispr/cas12a检测体系还包括lamp扩增产物、rna酶抑制剂、nebuffer 2.1、cas12a蛋白、ssdna报告分子和无酶水。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。
6.如权利要求1~5任意一项所述的试剂盒在制备鉴别rhdv1和rhdv2产品中的应用。
7.基于lamp-crispr/cas12...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋艳华，王芳，伍孟婷，陈萌萌，仇汝龙，范志宇，胡波，魏后军，葛雷，李一鸣，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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