【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、双链特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,简称dsn)是本世纪初从海洋生物中发现的一种特殊的核酸内切酶。与其他已知类型的核酸内切酶相比，dsn表现出独特的底物特异性，它特异性识别并水解双链dna或dna-rna杂合双链中的dna链，而对rna或单链dna几乎没有活性。并且，dsn对双链碱基配对的完整性有严格要求，双链中的极个别错配即可大幅降低dsn对底物的水解效率。鉴于其独特的底物特异性，已经被广泛用于生物医药的多个领域，如去除组织细胞中提取rna中残留的基因组dna污染，构建标准化cdna文库或高通量rna测序文库，快速检测mirna，快速检测单核苷酸多态性(snp)等。
2、由于dsn具备切割dna的能力，重组到基因工程菌中具有细胞毒性，会切割宿主基因组dna而抑制宿主细胞生长，重组表达难度较大。目前常用的表达策略是利用毕赤酵母进行分泌型表达，将dsn蛋白分泌到细胞外，从而避免细胞毒性。dsn分泌表达后的纯化工艺往往需要经过多步层析，操作较为繁琐，成本较高。如能简化纯化步骤，则可大大降低生产成本。
3、同时，由于dsn属于蛋白类制品，日常需要在-20℃下才能长期保存。如果在室温下暴露较长时间即会导致蛋白失活，37℃放置1天即损失大部分活性。因此，提高蛋白在室温下的稳定性，一直是生物工具酶类产品研发的关注点。
技术实现思路
1、专
2、本专利技术还提供了一种提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体的制备方法和应用。
3、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、进一步地，所述双链特异性核酸酶突变体的编码基因核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、进一步地，所述双链特异性核酸酶突变体由seq id no.3所示氨基酸序列为模板，将第83位的谷氨酸突变为丙氨酸(e83a)。
6、本专利技术所述重组载体，其包括双链特异性核酸酶突变体编码基因核苷酸序列。
7、本专利技术所述重组菌，其包双链特异性核酸酶突变体编码基因核苷酸序列或所述重组载体。
8、进一步地，所述重组菌的出发菌株为毕赤酵母。
9、本专利技术所述提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体的表达纯化方法，包括如下步骤：
10、(1)将所述双链特异性核酸酶突变体的编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体上，形成突变体重组表达质粒；
11、(2)将构建成功的表达质粒转化到毕赤酵母感受态细胞中，挑选阳性克隆，发酵，然后加入诱导剂；
12、(3)收集发酵液上清，纯化，获得高纯度的双链特异性核酸酶突变体蛋白。
13、本专利技术所述提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体在特异性切割双链dna中的应用。
14、本专利技术所述提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体的试剂盒。
15、本专利技术所述提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体的试剂盒在特异性切割双链dna中的应用。
16、本专利技术通过定点突变将野生型核酸酶的氨基酸序列(seq id no.3)第83位的谷氨酸突变为丙氨酸(e83a)，不仅可以高效表达，同时可以在37℃下放置3天仍有显著活性，并且特异性切割双链dna，对单链dna和rna均无活性。
17、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：
18、本专利技术设计的双链特异性核酸酶(dsn)突变体在37℃下放置3天仍有显著活性，其纯化反应只需一步亲和层析，具有很高的产品开发潜力，同时e83a可以特异性切割双链dna，对单链dna和rna均无活性。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体，其特征在于，所述双链特异性核酸酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述双链特异性核酸酶突变体，其特征在于，所述双链特异性核酸酶突变体的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述双链特异性核酸酶突变体，其特征在于，所述双链特异性核酸酶突变体在SEQ ID NO.3所示氨基酸序列基础上，将第83位的谷氨酸突变为丙氨酸(E83A)。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求2所述的基因序列。
5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括权利要求2所述的基因序列或权利要求4所述重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的出发菌株为毕赤酵母。
7.一种权利要求1所述提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.一种权利要求1所述提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体在特异性切割双链DNA中的应用。
9.一种含有权利要求1所述
10.一种权利要求9所述提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体的试剂盒在特异性切割双链DNA中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高稳定性的双链特异性核酸酶突变体，其特征在于，所述双链特异性核酸酶突变体氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述双链特异性核酸酶突变体，其特征在于，所述双链特异性核酸酶突变体的编码基因核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述双链特异性核酸酶突变体，其特征在于，所述双链特异性核酸酶突变体在seq id no.3所示氨基酸序列基础上，将第83位的谷氨酸突变为丙氨酸(e83a)。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求2所述的基因序列。
5.一种重组菌，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：任宏杰，罗志丹，黄庆媛，张旭宁，毕海，
申请(专利权)人：江苏愚公生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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