【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种通过沉默灰盖鬼伞胞外蛋白酶高效表达漆酶lcc5的方法，属于分子生物学和生物工程领域。
技术介绍
1、漆酶(ec1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于多铜氧化酶家族(bluemulticopper oxidases，mcos)。漆酶于19世纪80年代初由yoshida首次发现并将其正式命名为laccase，随后在真菌、动物和细菌中也发现了其存在。漆酶可与酚类、羧酸和芳胺化合物及其衍生物等250多种底物发生氧化反应。由于有着极高的催化效率，能够催化多种底物的氧化反应，且反应的唯一副产物为水，漆酶被视为一种绿色环保、潜力巨大的酶类催化剂。这种酶的应用范围包括广泛的化学过程和工业用途，如生物修复、纳米生物技术、木工工业、纸浆漂白、纺织工业染色、食品工业中的生物技术应用、生物精制、废水解毒、从酚和胺基质中生产有机物和生物燃料。
2、近年来，蛋白酶在工业上的需求与日俱增，而作为绿色催化剂的漆酶在各方面的需求更甚，但工业上大规模生产漆酶还存在着产量较低、周期过长以及成本过高等问题。所以，寻找和开发新的漆酶高产菌株仍是研究的重中之重。目前最常见的漆酶高产菌株获得的方法主要是：筛选野生型菌株，诱变育种优化菌株，同源或异源表达漆酶。灰盖鬼伞属于鬼伞科、鬼伞属，是一种蘑菇型担子真菌，常常被用作子实体发育的模式菌株，它的生活周期短，一般仅需要2周就可以培育完成。同时，灰盖鬼伞本身包含了17种漆酶同工酶，是漆酶表达的良好宿主。
3、研究表明，漆酶本身也会被其他蛋白酶所水解，同时漆酶的表达也会受到其他蛋白酶
技术实现思路
1、本专利技术为提高漆酶lcc5在灰盖鬼伞中的表达，提供了一种通过沉默mpr基因表达提高漆酶lcc5表达的方法。本方法是以金属蛋白酶干扰基因中的464bp的编码序列作为干扰序列，构建金属蛋白酶干扰载体。通过原生质体制备和真菌转化的方法整合到漆酶过表达菌株中。通过验证金属蛋白酶的抑制效果显示，金属蛋白酶的表达明显受到抑制，其基因水平抑制了60％左右，同时，在生长状态受到影响的情况下，漆酶的表达提升70％左右。
2、本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：
3、本专利技术通过沉默灰盖鬼伞胞外蛋白酶高效表达漆酶lcc5的方法，是通过降低灰盖鬼伞菌株(c.cinerea fa2222)金属蛋白酶的表达水平，间接提高漆酶lcc5的表达。其中降低灰盖鬼伞菌株中金属蛋白酶基因的表达水平是通过rna干扰(rnai)实现的。具体包括如下步骤：
4、步骤1：克隆c.cinerea fa2222中金属蛋白酶mpr的干扰序列；
5、步骤2：构建包含所述干扰序列的mpr干扰载体；
6、步骤3：mpr干扰载体转化漆酶过表达菌株lcc5得到蛋白酶干扰菌株；
7、步骤4：将步骤3获得的蛋白酶干扰菌株进行摇瓶培养，采用的培养基构成为：8～10g/lyeast extract，18～20g/lglucose，1～2g/l kh2po4，0.2～0.5g/l cacl2·2h2o，40～50mg/lmgso4·7h2o，摇床培养条件为37℃，转速120r/min。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述干扰序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。
9、进一步地，步骤1中，干扰序列的克隆方法为：提取c.cinerea fa2222总rna，然后反转录为cdna，以cdna为模板采用pcr扩增得到干扰序列。
10、所述pcr扩增所采用的引物为rmpr-f和rmpr-r，其核苷酸序列分别如seq id no:2和seq id no:3所示。
11、在本专利技术的一种实施方式中，所述mpr干扰载体的构建方法为：
12、将pysk-lcc1上的lcc1基因替换为mpr干扰基因，获得金属蛋白酶干扰质粒pysk-anti mpr，即为mpr干扰载体。具体包括：扩增载体pysk，进行核酸凝胶电泳以及回收目的片段，采用体外同源重组的方式进行连接，转入大肠杆菌jm109感受态进行基因扩增。验证阳性转化子，获得含有mpr干扰表达载体重组菌株。
13、步骤3中，将获得的金属蛋白酶干扰质粒pysk-anti mpr通过原生质体制备以及真菌转化的方法转化转入灰盖鬼伞(coprinopsiscinerea fa2222)漆酶过表达菌株中，经过筛选、验证，最终得到蛋白酶干扰重组菌株。
14、在本专利技术步骤3得到蛋白酶干扰重组菌株后，对蛋白酶干扰重组菌株进行摇瓶发酵分析，验证漆酶的表达情况。对蛋白酶干扰重组菌株进行摇瓶培养前，通过pcr验证蛋白酶干扰重组菌株，采用的引物为l22和l24，其核苷酸序列分别如seq id no:4和seq id no:5所示。pcr验证后，用qrt-pcr验证蛋白酶干扰重组菌株蛋白酶基因表达水平，检测所采用的引物为qmpr-f和qmpr-r，其核苷酸序列分别如seq id no:6和seq id no:7所示。内参基因为灰盖鬼伞β-actin基因，采用引物为β-actin-f和β-actin-r，其核苷酸序列分别如seqid no:8和seq id no:9所示。
15、对验证结果呈阳性的蛋白酶干扰重组菌株进行摇瓶培养，温度为37℃条件下，摇瓶培养检测漆酶活性，并筛选漆酶表达明显提升的菌株；并对蛋白酶干扰重组菌株进行1-l发酵罐培养，检测漆酶lcc5酶活，分析漆酶提升效果。
16、与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：
17、1、本专利技术提供了一种通过沉默金属蛋白酶基因表达提高灰盖鬼伞中漆酶lcc5的表达。通过这种方法获得的蛋白酶干扰重组菌株漆酶的表达明显提高70％，相应的菌株的发酵周期也延后3-4天，同时对该菌株的生长状态略有影响。
18、2、本专利技术利用的金属蛋白酶基因是一种胞外蛋白基因，已知的功能仅仅是一类引起菌株孢子量降低，生长速率减缓。
19、3、通过干扰金属蛋白酶基因的表达，在提高灰盖鬼伞对漆酶lcc5表达的同时，扩展了在丝状担子真菌中表达系统的发展。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种通过沉默灰盖鬼伞胞外蛋白酶高效表达漆酶Lcc5的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种通过沉默灰盖鬼伞胞外蛋白酶高效表达漆酶lcc5的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚动邦，冉杰，方泽民，刘娟娟，张学成，肖亚中，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。