【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及工程领域，具体而言涉及合成细胞器辅助的基因表达方法、dna构建体和表达系统及其应用。
技术介绍
1、基因表达通常是指将目的基因在宿主中合成和表达的过程。宿主常用的是各种细胞表达体系，例如细菌表达体系(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)，酵母表达体系、动物细胞表达体系(昆虫细胞、人源细胞)，宿主也可以是无细胞表达体系，如细胞裂解液。这一过程在生物技术、分子生物学和药物研发等领域中具有重要作用，因为它允许人们制备大量的目标产物，特别是目标重组蛋白的表达，用于研究、治疗或工业应用。
2、然而，表达过程与宿主的相互作用，会造成一系列复杂的技术和生物学挑战：
3、a.表达过程的能量物质负担：当试图表达外源基因时，宿主必须分配能量和资源来满足表达需求。这会导致细胞负担的增加，可能限制细胞的正常生长和健康状态。
4、b.表达产物造成的宿主压力：这增加了表达基因的困难，因为必须在宿主正常活性和蛋白表达之间找到平衡。特别的，当宿主为细胞表达系统时，细胞生长会被抑制、甚至停止。根据机制分类，宿主压力的来源包括：
5、a)外源产物会占据宿主中的空间，从而非特异性地干扰正常生理活性过程，产生一般性压力(general stress)。
6、b)有一些产物具有特异性的毒性，即使在极低表达水平下也会对宿主造成损害。例如，目标产物为核酸酶，会切割、降解宿主中的dna、rna；目标产物为外源trna，会导致蛋白翻译错误。
7、c.宿主内环境下，表达产物无法成熟：目标产物的成熟过程需要特
8、a)过表达外源蛋白时，常常会发生错误折叠，这些错误折叠的蛋白可能不具备正常的生物活性，并倾向于聚集成为难溶的包涵体。
9、b)在大肠杆菌中表达具有二硫键的蛋白质的时候，由于大肠杆菌细胞质基质的还原性环境，二硫键无法形成，蛋白质不能正确折叠。
10、c)一些目标产物，需要后处理才能具有正确活性，比如酶原的剪切，抗体的糖基化，rna的内含子切除，rna编辑。
11、这些困难是表达中常见的挑战，研究人员一直在探索各种方法和策略，以克服这些问题，以实现高效和可控的蛋白表达。
12、本专利技术旨在应对挑战b(宿主压力)和c(产物成熟)，提供一种创新的方法来改善表达，为相关领域的研究和应用带来新的可能性。
13、在本专利技术中，我们解决2个主要挑战，即表达产物造成的宿主压力(例如毒性蛋白的表达)以及宿主内环境下，表达产物无法成熟(例如蛋白质错误折叠)。这些挑战在生物技术和分子生物学领域经常出现，限制了表达的效率和可行性。以下是一些与这两个挑战相关的情况和现有技术，这些方法通常需要复杂的工作，而且不一定成功，目前还没有较为普适的解决方案：
14、a.选择合适的宿主系统：针对目标基因的特质，选择最适合的宿主表达系统。例如，使用无细胞体系表达细胞毒性蛋白，使用人源细胞系表达人源抗体。针对有二硫键的蛋白质，可以使用大肠杆菌shuffle等还原性酶缺失的突变菌株进行基因表达。但是许多宿主表达体系的使用成本和操作复杂度较高。而且这样的方法，仅适用于单基因表达，或若干性质相似的基因，而不能泛化到更复杂的dna构建体的表达。
15、b.表达载体工程：例如选择适当的启动子、调节表达强度、使用增强子等，来调整表达量。然而，这些方法很难同时满足多个目标，例如弱启动子可以避免过高的表达水平从而避免包涵体的形成，但该方法无法实现外源蛋白的高效表达。而强启动子会导致细胞负担增加，从而限制了目标蛋白的高效表达。
16、c.表达条件优化：控制细胞培养条件，如温度、ph值、氧气供应等，以及使用诱导表达系统，并调试诱导的条件，可以对表达量产生影响。例如，针对容易错误折叠形成沉淀的蛋白，可以使用低温的表达条件，促进正确折叠。但是，在某些情况下，这些优化可能无法有效地改善表达。
17、d.代谢工程：通过改变宿主的代谢途径，可以提高目标产物的产量。
18、e.蛋白工程：对于毒性蛋白或易形成包涵体的蛋白，已经提出了一些方法，例如改变蛋白结构、调整表达速率、使用特定的标签或分割蛋白，以减轻其对细胞的不利影响。但这些方法可能会导致表达效率下降。
19、f.后处理：可以对宿主产生的无活性的目标产物进行纯化后变复性、切割、修饰，从而恢复到正确的结构。但是后处理是一个非常复杂且昂贵的过程，对许多目标产物并不适用。
20、但是目前没有通用的解决方案，能够兼顾高表达、低压力/毒性、正确折叠、表达后修饰。
21、现有技术一涉及表达载体和表达条件的优化。
22、现有技术一的技术方案如下：在现有技术一中，通常采用表达载体和表达条件的工程策略来优化表达。
23、表达载体：选择适当的启动子、表达载体和受控元件，来控制基因表达，以优化表达。这可以通过调整表达载体中的拷贝数、启动子的活性等方式来实现。
24、表达条件：调整培养条件，如温度、ph值、氧气供应和培养基成分，如果诱导表达载体，还包括调整诱导条件。通过改变表达条件，以改善表达效率，也可以改善蛋白的折叠和稳定性。
25、现有技术一具有如下缺点：虽然现有技术一在一定程度上可以优化表达，但缺少明确的理论指导，针对不同的目的基因需要做大量的试错，且不一定有效。
26、现有技术二涉及表达宿主的优化。
27、现有技术二的技术方案如下：
28、针对目标基因的特质，选择合适的宿主，进行表达，然后再匹配相应的后处理步骤。
29、例如，使用人源细胞系或者昆虫动物细胞，表达动物来源的蛋白质。优化宿主的代谢网络，以及转录、翻译系统，可以进一步提高表达，例如使用工程化改造的cho细胞株用于抗体高表达生产，例如改造大肠杆菌内部的还原性环境获得的shuffle菌株，可以用于含二硫键的蛋白质的生产。
30、例如，使用无细胞表达体系作为一种替代方案，以应对细胞表达中的困难。无细胞表达体系通常包括以下关键步骤：
31、①细胞裂解和制备细胞提取物：从细胞中提取细胞质和核酸物质，以获得含有细胞的基本生物分子的提取物。
32、②添加外源dna或rna：向提取物中添加目标蛋白的编码dna或rna，通常是由合成生物学方法合成的。
33、③翻译和蛋白质合成：在体外环境中，使用细胞提取物中的细胞机器，如核糖体、trna和氨基酸，将目标蛋白进行翻译和合成。
34、④蛋白质纯化和提取：从反应体系中纯化和提取目标蛋白质，通常使用亲和层析、凝胶电泳或其他分离技术。
35、⑤分析和确认：对蛋白质进行分析和确认，以确保其结构和功能符合预期。
36、现有技术二具有如下缺点：
37、a)操作复杂度高：不同宿主的转化、转染步骤有显著的区别，学习门槛较高，而且部分宿主，较难进行遗传操作和培养。...
【技术保护点】
1.一种合成细胞器辅助的基因表达方法，其包括下述步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主包括无细胞表达体系和细胞宿主，优选的是，原核细胞宿主，更优选的是，大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成细胞器指人工设计的区室化结构，优选地，所述合成细胞器是无膜细胞器，是多肽和/或蛋白和/或DNA和/或RNA和/或核酸蛋白复合体在宿主中构建形成的生物分子凝聚体(biomolecular condensates)，优选的是，构建合成细胞器地生物大分子为连续重复10-1000次的核苷酸序列，例如三联体CAG，CCUG，GGGAA，GGGGCC等；连续重复3-500次的氨基酸序列，例如树脂蛋白样肽(resilin-likepeptides，RLP)的重复；内在非结构区域，例如FUS蛋白，ParB蛋白；多元生物大分子的多聚化，例如PTB蛋白与UCUCU序列重复，人工设计的二元蛋白质二维结构，人工设计的二元RNA二维结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因表达产物为RNA、蛋白质、核酸蛋白复合物，或者是异源
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，所述基因表达产物通过非特异性和/或特异性的结合定位至合成细胞器，优选地，使用特异性的受体/配体对，所述合成细胞器具有受体，所述基因表达产物连接有配体，使得所述合成细胞器能够特异性地结合所述基因表达产物，优选地，所述受体/配体对包括：互补配对的核酸分子；MS2、PP7、Qbeta等RNA噬菌体的衣壳蛋白和翻译操纵子RNA发卡；分裂蛋白的两段，例如裂绿色荧光蛋白、beta-半乳糖苷酶的alpha片段和omega片段，裂T7 RNA聚合酶。
6.一种DNA构建体，其包含引导宿主构建权利要求1至5中任一项所述的方法中定义的合成细胞器的核苷酸序列1，和/或引导、调控权利要求1至5中任一项所述的方法中定义的基因表达产物生成的核苷酸序列2，优选地，DNA构建体由所述核苷酸序列1、2与质粒载体构成，所述质粒载体例如pACYC184，pACYC177，pET28a(+)、pET28b(+)、pET-5a(+)、pET43.1a、pET-37b(+)、pCDFDuet-1,pCOLADuet-1,pRSFDuet-1,pETDuet-1、pUC57、pUC19、pBAD，pBluescript II SK(+)、pTrcHis C、pTrcHis A、pTrcHis2C、pBV221、pQE-70、pColdIII、pRSET-CFP、pRSET-BFP、pGFPuv、pKD46、pKD4、pTYB1、PinPoint Xa-2、pTWIN1、pRSET C、pSB1C3、pSB3C5、pSB4C5、pSB4K5，优选的是，上游启动子是常表达启动子或诱导型启动子。
7.一种表达系统，其包括权利要求6要求所述的DNA构建体，优选的是，所述表达系统指在原核细胞中同时构建所述合成细胞器、并生成所述基因表达产物的系统，更优选地，所述表达系统是大肠杆菌表达系统。
8.合成细胞器在消除基因表达对宿主的压力和/或毒性以及/或者将基因表达产物与宿主内环境解耦连的方面的应用，其包括使所述合成细胞器与基因表达产物在所述宿主中共表达，所述基因表达产物能够定位至合成细胞器。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括改善宿主的生理活性和耐受性、同等条件下的生物量、基因表达速率和/或细胞生长速率。
10.如权利要求4所述的方法或者权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因表达产物在所述合成细胞器中成熟，优选所述成熟包括以下中的一种或多种：生物大分子的折叠；表达后修饰，如二硫键形成，糖基化修饰，甲基化修饰，乙酰化修饰；切割、连接，如酶原切割活化，RNA剪切，内含肽介导的蛋白质剪切，自身环化；非共价组装，如二聚化，多聚化。
...【技术特征摘要】
1.一种合成细胞器辅助的基因表达方法，其包括下述步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主包括无细胞表达体系和细胞宿主，优选的是，原核细胞宿主，更优选的是，大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成细胞器指人工设计的区室化结构，优选地，所述合成细胞器是无膜细胞器，是多肽和/或蛋白和/或dna和/或rna和/或核酸蛋白复合体在宿主中构建形成的生物分子凝聚体(biomolecular condensates)，优选的是，构建合成细胞器地生物大分子为连续重复10-1000次的核苷酸序列，例如三联体cag，ccug，gggaa，ggggcc等；连续重复3-500次的氨基酸序列，例如树脂蛋白样肽(resilin-likepeptides，rlp)的重复；内在非结构区域，例如fus蛋白，parb蛋白；多元生物大分子的多聚化，例如ptb蛋白与ucucu序列重复，人工设计的二元蛋白质二维结构，人工设计的二元rna二维结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因表达产物为rna、蛋白质、核酸蛋白复合物，或者是异源dna编码合成的小分子，优选的是，重组蛋白质，例如，超折叠绿色荧光蛋白、限制性内切酶dpni、限制性内切酶bsai、人胰岛素原或ror-alpha，优选的是，所述基因表达产物在所述合成细胞器中成熟。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，所述基因表达产物通过非特异性和/或特异性的结合定位至合成细胞器，优选地，使用特异性的受体/配体对，所述合成细胞器具有受体，所述基因表达产物连接有配体，使得所述合成细胞器能够特异性地结合所述基因表达产物，优选地，所述受体/配体对包括：互补配对的核酸分子；ms2、pp7、qbeta等rna噬菌体的衣壳蛋白和翻译操纵子rna发卡；分裂蛋白的两段，例如裂绿色荧光蛋白、beta-半乳糖苷酶的alpha片段和omega片段，裂t7 rna聚合酶。
6.一种dna构建体，其包含引导宿主构建权利要求1至...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭昊天，陈炯霖，姜楠，熊关越，
申请(专利权)人：小熊猫有限公司，
类型：发明
国别省市：
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