【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药生物领域，具体是指一种标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体及其构建和应用方法。
技术介绍
1、骨架蛋白是细胞中起结构支撑作用的一类蛋白质，其在细胞力学调控、下游信号转导改变、基因表达调控等方面具有重要作用。心脏中，骨架蛋白直接介导了心脏的收缩舒张功能。骨架蛋白的变异是造成心脏疾病的主要原因之一，在心脏疾病的诊断和治疗中具有重要价值。由于心脏骨架蛋白本身溶解度低，传统的分子互作研究技术，如免疫共沉淀coip等，难以精确系统地研究动物体内与心脏骨架蛋白联系的临近分子。为了解决这个问题，之前有研究开发了bioid技术(k.j.roux,d.i.kim,m.raida,b.burke,a promiscuousbiotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins inmammalian cells.journal of cell biology 196,801-810,2012)，在细胞中将骨架蛋白与突变的生物素转移酶bira*融合，从而在骨架蛋白附近，用生物素标记其他分子。进一步利用生物素-链霉亲和素的特异的强相互作用，科学家能够富集和鉴定骨架蛋白附近的生物素标记的分子，从而发现临近骨架蛋白的其他分子。
2、早期的bioid技术由于缺乏成熟有效的体内递送载体，仅用于体外培养的细胞研究(p.li,j.li,l.wang,l.j.di,proximity labeling of interacting prote
3、为了在动物体内运用此技术，有科学家开发了腺相关病毒载体(adeno-associatedvirusvector,aav)，向体内心脏中递送bioid系统，实现了动物体内的临近蛋白组学分析，例如在动物体内的心肌细胞的细胞膜-内质网膜二联体(dyad)附近标记蛋白的技术(lu,f.,ma,q.,xie,w.etal.cmya5establishescardiacdyadarchitectureandpositioning.natcommun13,2185,2022)。其主要缺点有：①细胞膜-内质网膜二联体(dyad)临近分子多为可溶性生物膜相关分子，该技术是否能够应用到可溶性低的骨架蛋白，特别是肌原纤维、细胞核与闰盘等其他亚细胞空间的骨架蛋白，并不清楚；②该技术利用bira*为临近标记酶，酶活性较低，能否用更高效的bioid2或turboid酶进行临近标记，如何进行技术配套优化，并不清楚。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种心肌细胞特异性地标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒载体及其构建和应用方法。具体公开了标记心脏肌原纤维z线、核纤层、闰盘这三种心脏细胞骨架的腺相关病毒载体序列及应用。相比于传统的细胞内邻近标记系统，本体系可以对体内难溶性骨架蛋白做心脏特异性临近标记。实施例证明其在标记亚细胞结构相关骨架蛋白的临近分子的通用性，具有较大的应用前景。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一方面，本专利技术提供一种心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒(aav)载体，包含：aav蛋白衣壳和aav核酸分子；其中，所述aav蛋白衣壳为选自aav2i8、aav1、aav6、aav8、aav9和/或myoaav中的一种或多种；所述aav核酸分子包含心肌细胞特异性启动子、骨架蛋白基因和具有临近标记功能的生物素连接酶基因。
4、所述aav核酸分子由4部分构成：①itr(inverted terminal repeat)，反向末端重复序列：能形成高度稳定的二级结构，在病毒的复制和包装过程中起着必要作用。②心肌细胞特异性启动子：驱动aav转基因在心肌细胞中特异性表达。③goi(gene of interest)基因，即心脏骨架蛋白基因：包括但不限于actn2、lmna、lmnb1、ctnna3或jup基因。标记肌原纤维z线的actn2(actinin alpha2)基因，编码辅肌动蛋白α2，是心肌细胞肌小节z线结构的重要组成部分，在心肌纤维排列方面起着重要的作用，同时还协调着肌小节细胞骨架与细胞膜的相互连接。标记核纤层的lmna、lmnb1基因，分别编码核纤层蛋白a、核纤层蛋白b1，是核纤层的骨架蛋白。标记闰盘的ctnna3、jup基因，分别编码连环蛋白3和连接斑珠蛋白，是闰盘介导细胞连接的核心结构蛋白。④生物素连接酶基因：包括但不限于bioid2、turboid的编码基因，其编码蛋白融合连接在骨架蛋白的n端或c端，催化骨架蛋白临近的10nm范围内的内源分子生物素化。
5、在本专利技术的一些实施例中，心脏骨架蛋白包括心脏肌原纤维z线、核纤层或闰盘的主要结构蛋白。肌原纤维(myofibril)：横纹肌细胞的收缩舒张马达，由粗肌丝和细肌丝组装而成。粗肌丝的主要成分是肌球蛋白，细肌丝的主要成分是肌动蛋白，辅以原肌球蛋白和肌钙蛋白。肌原纤维由肌小节(sarcomere)头尾重复连接而成，连接处形成特殊的横纹结构，称作z线。z线将细肌丝、肌联蛋白等纤维交联在一起，核心交联蛋白为辅肌动蛋白(α-actinin)。心肌细胞中的主要辅肌动蛋白亚型为actn2(actinin alpha2，α-actinin-2)。
6、核纤层(nuclear lamina)：核纤层普遍存在于高等真核细胞中，是内层核被膜下纤维蛋白片层，纤维纵横排列整齐呈纤维网络状。核纤层在核内与核基质连接，在核外与中间纤维相连，构成贯穿于细胞核和细胞质的统一网架结构体系。形成核纤层的核心结构蛋白称为核纤层蛋白(lamin)，属于五型中间纤维蛋白家族。成熟心肌细胞中主要表达的核纤层蛋白亚型为lamin-a/c和lamin-b1，分别由lmna和lmnb1基因编码。
7、闰盘(intercalated disk)：闰盘由相邻两个心肌细胞的细胞膜分支处伸出的短突相互嵌合而成，能使电兴奋和机械力从一个细胞传播到另一个细胞，利于心肌纤维同步收缩。在闰盘部位，心肌本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒(AAV)载体，其特征在于，包含：AAV蛋白衣壳和AAV核酸分子；
2.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，AAV核酸分子包含心肌细胞特异性启动子的核苷酸序列，所述心肌细胞特异性启动子包括人源Tnnt2启动子序列或鸡源Tnnt2启动子序列中的一种；所述Tnnt2启动子序列如SEQ ID No.1所示，所述鸡源Tnnt2启动子序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，AAV核酸分子包含骨架蛋白基因编码核酸序列，所述骨架蛋白基因包括标记肌原纤维Z线的ACTN2基因、标记核纤层的LMNA或LMNB1基因或标记闰盘的CTNNA3或JUP基因中的一种；
4.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述生物素连接酶基因的编码核酸序列包括BioID2或TurboID中的一种；
5.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述骨架蛋白基因和生物素连接酶基因编码序列之间，不含终止密码子TAA/TAG/TGA。
6.如
7.如权利要求1-6中任一项所述的心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的AAV载体的构建方法，其特征在于，所述AAV载体包含权利要求1-7中任一项所述的核酸序列，所述构建方法包括如下步骤：
8.如权利要求1-6中任一项所述的AAV载体在心肌细胞中特异性进行骨架蛋白临近标记的方法，所述方法包括如下步骤：
9.一种心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的试剂，其特征在于，所述试剂包含权利要求1-6中任一项所述的AAV载体。
10.一种心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6中任一项所述的AAV载体，还包含所述AAV载体的试剂和/或应用AAV载体在心肌细胞中特异性进行骨架蛋白临近标记的生物素、链霉亲和素磁珠、缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种心肌细胞特异性标记心脏骨架蛋白临近分子的腺相关病毒(aav)载体，其特征在于，包含：aav蛋白衣壳和aav核酸分子；
2.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，aav核酸分子包含心肌细胞特异性启动子的核苷酸序列，所述心肌细胞特异性启动子包括人源tnnt2启动子序列或鸡源tnnt2启动子序列中的一种；所述tnnt2启动子序列如seq id no.1所示，所述鸡源tnnt2启动子序列如seq id no.2所示。
3.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，aav核酸分子包含骨架蛋白基因编码核酸序列，所述骨架蛋白基因包括标记肌原纤维z线的actn2基因、标记核纤层的lmna或lmnb1基因或标记闰盘的ctnna3或jup基因中的一种；
4.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述生物素连接酶基因的编码核酸序列包括bioid2或turboid中的一种；
5.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述骨架蛋白基因和生物素连接酶基因编...
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