本发明专利技术公开了通过破坏病毒Ｇａｇ衣壳（ＣＡ）蛋白（ｐ２４）从ＣＡ－间隔肽１（ＳＰ１）蛋白前体（ｐ２５）的加工来抑制ＨＩＶ－１的复制。还包括了含有Ｇａｇ ｐ２５蛋白突变的氨基酸序列，该突变导致二甲基琥珀酰桦木酸或二甲基琥珀酰白桦脂醇对ｐ２５加工成ｐ２４的抑制降低；编码该突变序列的多核苷酸和选择性结合该突变序列的抗体。包括了抑制方法，抑制性化合物和发现靶向ＨＩＶ Ｇａｇ蛋白的蛋白酶解加工的抑制性化合物的方法。一实施方案中，这样的化合物通过结合Ｇａｇ而不是蛋白酶来抑制ＨＩＶ蛋白酶与Ｇａｇ的相互作用。另一实施方案中，在Ｇａｇ蛋白酶解切割位点区域中含有突变的病毒或重组蛋白可以用于筛选测试中来鉴定靶向蛋白酶解加工的化合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】关于联邦政府资助研究和发展的声明根据NIH/NIAID给予的拨款No.2R44AI051047-02的条款，U.S.政府在本专利技术中具有已支付的许可并在有限的情况中可具有权力来要求专利持有者以合理条件许可其他人实施。
技术介绍
专利
本专利技术包括抑制方法，抑制剂和发现HIV感染抑制剂的方法。背景人免疫缺陷病毒(HIV)是慢病毒属的成员，慢病毒属是逆转录病毒的亚科。病毒基因组含有许多允许病毒控制其在静息细胞和分裂细胞两者中的复制速率的调控元件。最重要的是，HIV感染并侵袭免疫系统的细胞；它破坏身体的免疫系统并使得患者易于产生机会性感染和肿瘤。免疫缺陷似乎是渐进的和不可逆的，在几年内具有接近100％的高死亡率。HIV-1是亲T4淋巴细胞的并对其致细胞病变，T4淋巴细胞是表达细胞表面分化抗原CD4的免疫系统细胞，也称为OKT4，T4和leu3。病毒向性是由于病毒包膜糖蛋白gp120和细胞表面CD4分子之间的相互作用而引起的(Dalgeish等，Nature 312763-767(1984))。这些相互作用不仅介导了HIV对易感细胞的感染，而且还引起病毒诱导的感染和未感染T细胞的融合。这种细胞融合导致HIV感染患者中巨大多核化合胞体的形成，细胞死亡和CD4细胞的渐进性耗尽。这些事件导致HIV诱导的免疫抑制及其随后的后遗症，机会性感染和肿瘤。除了CD4+T细胞，HIV的宿主范围包括单核吞噬细胞谱系的细胞(Dalgleish等，上文)，包括血液单核细胞，组织巨噬细胞，皮肤的朗格汉斯细胞和淋巴结内的树突网状细胞。HIV还是亲神经性的，能够感染中枢神经系统中的单核细胞和巨噬细胞，引起严重的神经损伤，巨噬细胞和单核细胞是HIV的主要存储地。它们可以与带有CD4的T细胞相互作用并融合，导致T细胞耗尽并因此引起AIDS的发病。在治疗HIV-1的药物研发中已经获得了相当大的进展。用于HIV的治疗剂包括，但不限于，AZT，3TC，ddC，d4T，ddI，替诺福韦(tenofovir)，阿巴卡韦(abacavir)，奈韦拉平(nevirapine)，地拉韦定(delavirdine)，恩曲他宾(emtricitabine)，依法韦伦(efavirenz)，沙喹那韦(saquinavir)，利托那韦(ritonavir)，茚地那韦(indinavir)，奈非那韦(nelfinavir)，洛匹那韦(lopinavir)，安普那韦(amprenavir)，atazanavir和福沙那韦中的至少一种，或任何其他相互组合的抗逆转录病毒药物或抗体，或与基于生物学的治疗相关，例如，gp41-衍生的肽enfuvirtide(Fuzeon；Timeris-Roche)和T-1249(Trimeris)，或可溶性CD4，CD4的抗体，和CD4或抗CD4的缀合物，或在此另外呈现的。这些药物的组合特别有效并可以将血浆中的病毒RNA水平降低至不可检测的水平并减缓病毒抗性的发展，结果是患者健康和寿命的提高。尽管有了这些进展，但目前可利用的药物方案仍然存在问题。许多药物呈现出严重的毒性，具有其他副作用(例如，脂肪再分配)或需要复杂的减少并发症的给药时间表并因此限制了功效。随着延长的时间段，甚至在联合治疗时，经常出现HIV的抗性株。这些药物的高成本对于它们的广泛使用也是一个限制，尤其在发达国家以外的地方。对于研发另外的药物来避免这些问题仍然存在较大的需要。理想地，这些药物将靶向病毒生命周期的不同阶段，加入医疗物质用于联合治疗，且呈现最小的毒性，还具有较低的制造成本。HIV病毒粒体的装配发生在感染细胞的表面膜，在那里病毒Gag多蛋白质聚集，导致从细胞表面出芽的未成熟病毒粒体的装配。在病毒粒体内，Gag通过病毒蛋白酶(PR)裂解成基质(MA)，衣壳(CA)，核衣壳(NC)和C-端p6结构蛋白(Wiegers K.等，J.Virol.722846-2854(1998))。Gap加工诱导内部病毒粒体结构的重构(称为“成熟”的过程)。在成熟HIV颗粒中，MA排列于膜的内表面，而CA形成圆锥形的核，其包围与NC复合的基因组RNA。对于颗粒形成不需要裂解和成熟，但是其对于感染性是必要的(Koh1，N等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854686-4690，(1998))。CA和NC以及NC和p6分别通过14和10个氨基酸(p2)的短间隔肽(各自为间隔肽1(SP1)和SP2)在Gag多蛋白质上隔开(WiegersK.等，J.Virol.722846-2854(1998)，Pettit，S.C.等，J.Virol.688017-8027(1994)，Liang等，J.Virol.7611729-11737(2002))。这些间隔肽在颗粒成熟过程中通过在其N和C末端PR-介导的裂解来释放。HIV Gag和Gag-Pol多蛋白质上的各个切割位点以不同的速率得到加工，且这种顺次的加工导致在终产物之前Gag中间产物短暂出现。这样的中间产物对于病毒粒体形态发生或成熟可能是重要的，但对成熟病毒颗粒的结构没有贡献(Weigers等和Pettit等，上文)。最初的Gag裂解事件发生在SP1的C末端并将N-末端MA-CA-SP1中间产物与C-末端NC-SP2-p6中间产物分开。随后将MA与CA-SP1以及将NC-SP2与p6分开的裂解以低约10倍的速率发生。SP1从CA C末端的裂解是最后的事件并以比SP1-NC位点的裂解低400倍的速率发生(Weigers等和Pettit等，上文)。将未裂解的CA-SP1中间产物蛋白可供选择地称为“p25”，而将裂解的CA蛋白可供选择地称为“p24”，并将裂解的SP1肽可供选择地称为“p2”。SP1从CA C末端的裂解似乎是Gag加工级联中最后的事件之一，并是最终的衣壳凝聚和成熟的感染性病毒颗粒的形成所需的。成熟病毒粒体的电子显微相片揭示了颗粒具有电子致密圆锥性核心。另一方面，对CA-SP1裂解缺陷型病毒颗粒的电子显微镜研究表明颗粒具有球形电子致密核糖核蛋白核心以及恰位于病毒膜内的新月形电子致密层(Weigers等，上文)。已经表明CA-SP1切割位点处或附近的突变抑制了Gag加工并破坏了正常的成熟过程，因此导致无感染性病毒颗粒的产生(Weigers等，上文)。这些颗粒在表型上呈现Gag加工的缺陷(其自身表现为蛋白质印迹分析中p25(CA-SP1)条带的存在)以及上述由缺陷衣壳凝聚引起的异常颗粒形态。之前，从棒花赤楠(Syzigium claviflorum)中分离出桦木酸和platanic acid并测定其具有抗HIV活性。桦木酸和platanic acid呈现出对抗H9淋巴细胞中HIV-1复制的抑制活性，各自具有1.4μM和6.5μM的EC50，和各自9.3和14的治疗指数(T.I.)值。桦木酸的氢化产生了二氢桦木酸，其显示出略微更有效的抗HIV活性，具有0.9的EC50值和14的T.I.值(Fujioka，T.，等，J.Nat.Prod.57243-247(1994))。用某些取代的酰基如3’，3’-二甲基戊二酰基和3’，3’-二甲基琥珀酰基对桦木酸酯化产生了具有提高活性的衍生物(Kashiwada，Y.，等，J.Med.Che本文档来自技高网...
【技术保护点】
治疗患者ＨＩＶ－１感染的方法，包括给药抑制病毒Ｇａｇ ｐ２５蛋白（ＣＡ－ＳＰ１）加工成ｐ２４（ＣＡ）但不显著影响其他Ｇａｇ加工步骤的化合物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：K扎尔茨韦德尔，李锋，CT韦尔德，GP阿拉维，EO弗里德，
申请(专利权)人：帕纳克斯医药公司，由卫生与公众服务部部长代表的美利坚合众国政府，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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