【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种用于鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度的snp分子标记引物组及其应用。
技术介绍
1、花椰菜(brassica oleracea l.var.botrytis)是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，起源于地中海沿岸，于十九世纪传入我国。目前我国是世界上花椰菜栽培面积大的国家。但是生产中，我国栽培的花椰菜品种以‘白玉80’、‘s100’等为主，品种较为单一。随着人民生活水平的提高，对花椰菜品种需求也出现多元化。因此，培育具有自主知识产权的彩色花椰菜新品种，对促进我国花椰菜产业发展和满足人们日益增长的生活需求具有重要意义。
2、近年来，我国花椰菜育种家经过多年的努力选育出了一系列的花椰菜新品种。开发快速精准的品种鉴定方法为遗传纯度分析、鉴定品种真伪、保护新品种的自主知识产权奠定基础，具有重要的实用价值。传统鉴定方法是通过田间表型观测调查，比较费时、费工、占地，且受季节限制。近年来，人们利用现代分子生物学技术开发了多种品种快速、精准鉴定的方法，如，kasp(kompetitiveallele specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)。
3、‘紫霞65’是由浙江省农业科学院蔬菜研究所自主选育的优质早熟紫色花椰菜杂交种。2023年5月申请国家植物新品种保护。‘紫霞65’定植后约65天采收。生长迅速，植株健壮整齐，花球半松，球面蕾粒细密，呈紫红色，富含花青素；花梗淡绿、长度中等，口感脆嫩。为确保‘紫霞65’杂交种的种子纯度以及规范紫色花椰菜杂交种种业，开发了一种准确和稳定的检测
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种用于鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度的snp分子标记引物组及其应用，可实现‘紫霞65’种子的高通量、高效率纯度鉴定，为紫色花椰菜品种‘紫霞65’的推广提供了强有力的技术支撑，为实现该紫色花椰菜品种的遗传纯度鉴定、真伪鉴别及保护提供技术支持。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度的snp分子标记引物组，该引物组包含：3组snp标记引物组，分别记为s011引物组、s012引物组和s026引物组；其中，所述s011引物组中，两条正向引物的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述s012引物组中，两条正向引物的核苷酸序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述s026引物组中，两条正向引物的核苷酸序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.9所示。
3、优选地，如seq id no.1、seq id no.4和seq id no.7所示的正向引物上连接有fam荧光标记；如seq id no.2、seq id no.5和seq id no.8所示的正向引物上连接有hex荧光标记。
4、本专利技术的另一目的是提供一种引物如所述的snp分子标记引物组的kasp试剂检测盒。
5、本专利技术的另一目的是提供一种引物如所述的snp分子标记引物组的基因芯片。
6、本专利技术的另一目的是提供所述的snp分子标记引物组或所述的kasp试剂检测盒或所述的基因芯片在鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度或种子真实性中的应用。
7、本专利技术的另一目的是提供一种鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度或种子真实性的方法，该方法包含以下步骤：
8、(1)提取待测花椰菜基因组dna；
9、(2)向步骤(1)提取的dna模板中加入特异的kasp引物混合液和通用的kaspmastermix，进行pcr扩增；其中，所述特异的kasp引物混合液为如权利要求1或2所述的snp分子标记引物组；
10、(3)采用荧光检测仪分析pcr扩增产物，根据基因分型结果，判定待测样本为亲本、杂交种或异型株，判定标准如下：
11、对于每个样本，若3个snp标记的基因型结果均与父本或母本的基因型一致，则可判定该样本为父本或母本；若3个snp标记的基因型结果为父母本基因型的杂合态，则判定该样本为‘紫霞65’杂交种；若3个snp标记的基因型结果中同时出现父母本和‘紫霞65’杂交种的基因型，则判定该样本为异型株。
12、优选地，所述通用的kasp mastermix包含：通用的fret cassette荧光引物、rox内参染料、kleartaq dna聚合酶、dntp和mgcl2。
13、优选地，所述pcr的反应体系为：5μl通用的kasp mastermix、0.14μl特异的kasp引物混合液和5μl 20ng/μl模板dna；其中，各引物的终浓度均为5nm。
14、优选地，所述pcr的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
15、优选地，所述‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度的计算公式为：
16、pur(％)＝[(n-p-h)/f]×100％
17、其中，pur为种子纯度；n为待测样本数；p为亲本单株数；h为异型株数；f为杂交种数。
18、本专利技术的用于鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度的snp分子标记引物组及其应用，具有以下优点：
19、本专利技术基于前期236份花椰菜代表性材料的指纹图谱数据，基于高通量的kasp基因分型平台，对100个snp位点进行筛选，根据多态性指数、最小等位基因频率、基因分型的质量、结果的重复性等，筛选出适用于‘紫霞65’种子纯度鉴定的3个snp位点，并设计出用于检测snp位点的共9条引物序列。利用这9条引物序列，可实现‘紫霞65’种子的高通量、高效率纯度鉴定。本专利技术还提供了判定种子为亲本、杂交种或异型株，并计算纯度的方法，为紫色花椰菜品种‘紫霞65’的推广提供了强有力的技术支撑，为实现该紫色花椰菜品种的遗传纯度鉴定、真伪鉴别及保护提供技术支持。
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1.一种用于鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度的SNP分子标记引物组，其特征在于，该引物组包含：3组SNP标记引物组，分别记为S011引物组、S012引物组和S026引物组；
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记引物组，其特征在于，如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.7所示的正向引物上连接有FAM荧光标记；如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8所示的正向引物上连接有HEX荧光标记。
3.一种引物如权利要求1或2所述的SNP分子标记引物组的KASP试剂检测盒。
4.一种引物如权利要求1或2所述的SNP分子标记引物组的基因芯片。
5.如权利要求1或2所述的SNP分子标记引物组或权利要求3所述的KASP试剂检测盒或权利要求4所述的基因芯片在鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度或种子真实性中的应用。
6.一种鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度或种子真实性的方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述通用的KASP M
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：5μL通用的KASPMaster mix、0.14μL特异的KASP引物混合液和5μL20ng/μL模板DNA；其中，各引物的终浓度均为5nM。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度的计算公式为：
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度的snp分子标记引物组，其特征在于，该引物组包含：3组snp标记引物组，分别记为s011引物组、s012引物组和s026引物组；
2.根据权利要求1所述的snp分子标记引物组，其特征在于，如seq id no.1、seq idno.4和seq id no.7所示的正向引物上连接有fam荧光标记；如seq id no.2、seq id no.5和seq id no.8所示的正向引物上连接有hex荧光标记。
3.一种引物如权利要求1或2所述的snp分子标记引物组的kasp试剂检测盒。
4.一种引物如权利要求1或2所述的snp分子标记引物组的基因芯片。
5.如权利要求1或2所述的snp分子标记引物组或权利要求3所述的kasp试剂检测盒或权利要求4所述的基因芯片在鉴定‘紫霞65’花椰菜杂交种纯度或种子真实性中的应用。
6.一种鉴定‘紫霞65’花椰菜杂...
【专利技术属性】
技术研发人员：虞慧芳，顾宏辉，盛小光，沈钰森，王建升，宋蒙飞，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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