【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于荧光探针领域，具体涉及一种检测酪氨酸酶的双通道近红外比率荧光探针及其制备方法和用途，以实现在细胞中对酪氨酸酶双通道近红外荧光成像，具有选择性专一、检测高效、生物相容性良好的优点。
技术介绍
1、作为生命的基本单位，细胞是执行各种生物活动的巧妙而复杂的化学机器，用于执行各种不同的生物活动。细胞内存在的各种生物小分子和大分子，相互协调执行多种复杂的生物学功能。酶是最重要的细胞内的一类关键大分子，在正常生活至关重要的各种催化反应。其中酪氨酸酶是一种普遍存在的含铜氧化酶，广泛存在于微生物、植物、动物和其他生物系统中。可催化酪氨酸或酪胺的羟基化，并进一步氧化底物，在生命系统中得到相应的邻醌产物。大量研究表明，酪氨酸酶水平的失衡会导致许多严重的疾病，此外，上调的酪氨酸酶被认为是恶性黑色素瘤和肝癌的重要生物标志物，并已被广泛研究。因此，检测酪氨酸酶活性具有重大意义。
2、目前，由于制备简单、灵敏度超高、选择性高和活生物体成像能力，已经开发出许多用于酪氨酸酶(tyr)检测的荧光探针。然而，这些探针大多是为恶性黑色素瘤诊断而设计的，并且具有明显的缺点，例如斯托克斯位移小，单通道成像，这可能导致强烈的自发荧光和较差的荧光信噪比。这些缺陷可能严重影响体外和体内酪氨酸酶的检测和成像。因此，迫切需要一种能够成功克服这些缺点并具有区分不同细胞系中酪氨酸酶水平能力的新型酪氨酸酶比率荧光探针。
技术实现思路
1、针对现有技术所存在的不足，本专利技术提供了一种检测酪氨酸酶的双通道近红外比率
2、本专利技术双通道近红外比率荧光探针通过酪氨酸酶活性变化来对细胞内酪氨酸酶含量进行判别。此外，接受电子的喹啉阳离子与氧杂蒽衍生物相连，形成的供体-受体(d-π-a)结构，有利于红荧光到近红外发射区和较大的斯托克斯位移。基于上述设计策略，我们成功合成了探针lzd，这是一种nir比率荧光探针。在活细胞中被酪氨酸酶响应后，探针lzd由红色荧光团部分转化为绿光荧光团，因此其具有良好的双通道成像能力。它还对tyr表现出高灵敏度和选择性。同时，该比率探针已被应用于测定细胞中的tyr活性，并取得了显著的效果。
3、本专利技术双通道近红外比率荧光探针，简记为lzd，以氧杂蒽衍生物为母体，其结构式如下所示：
4、
5、本专利技术双通道近红外比率荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
6、步骤1：将30ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与10ml二氯甲烷(dcm)混合，在0℃下滴加三溴化磷，移出冰水浴滴加环己酮；反应六小时后将反应液滴加于150ml水中，再用碳酸钠调中性，再用水和dcm萃取，旋干得中间体1；
7、步骤2：将9.4g中间体1、5.3g 2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、17g碳酸钾加入到30mldmf中反应12h，再用水和dcm萃取，旋干，打浆(乙酸乙酯：石油醚＝1:1，v/v)，抽滤得中间体2；
8、步骤3：将0.5g 3-羟基苯甲醇加入到15ml dcm中，在0℃下滴加三溴化磷，室温反应2h，25ml dcm稀释，萃取(水/dcm)，旋蒸得中间体3；
9、步骤4：将2.25g中间体3和1.7g四甲基喹啉加入到25ml乙醇中，80℃回流12h，旋干溶剂，柱层析分离(甲醇：二氯甲烷＝1:20，v/v)得中间体4；
10、步骤5：将200mg中间体2、206mg中间体4和两滴哌啶加入到5ml乙醇中，80℃回流12h，旋干溶剂，乙酸乙酯打浆得中间体5；
11、步骤6：将100mg中间体5、42mg tea加入到2ml dcm中，在0℃下滴加三溴化磷35mg，室温下过夜反应，旋干溶剂，柱层析分离(甲醇：二氯甲烷＝1:20，v/v)得目标产物lzd。
12、本专利技术合成路线如下所示：
13、
14、本专利技术双通道近红外比率荧光探针的用途，是以非治疗或诊断为目的，用于制备酪氨酸酶检测试剂，所述检测试剂能够以双通道成像的方式实现细胞中内源性和外源性酪氨酸酶的检测。
15、进一步地，以所述检测试剂检测酪氨酸酶时，检测体系中715nm处荧光强度与510nm处荧光强度之比(i715/i510)与酪氨酸酶的浓度之间存在线性关系。
16、检测方法如下：
17、将本专利技术lzd溶于dmso中制得2mm的母液，各取15μl母液于3ml不同含量酪氨酸酶的hepes溶剂中，获得10μmlzd在不同测试液中的荧光和紫外谱图。随着酪氨酸酶含量的降低，lzd的吸光度在420nm处升高600nm降低，分别以420nm和600nm作为激发波长，荧光在510nm处下降和715nm处上升，表明其具有双通道成像能力。接着对lzd进行了分子对接模拟，表明其可通过氢键和分子间作用力与酪氨酸酶牢牢结合。通过mtt(5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四唑溴化物)方法进行了暗细胞毒性实验。lzd在活hepg2细胞中加入各种浓度(0μm，5.0μm，10.0μm，15.0μm，20.0μm)，在黑暗中孵育24小时后测试，细胞的活力没有影响。探究lzd在细胞中酪氨酸酶的成像能力，对加入lzd的细胞进行了不同时间的监测，红色通道和绿色通道荧光没有发生变化。以上结果为表明lzd在细胞中可通过双通道稳定成像。探究lzd在细胞中酪氨酸酶双通道检测能力，与含有酪氨酸酶的样品相比，对照组的绿光发射减弱且红色发射增强。接着对样品加入酪氨酸酶抑制剂，样品组的绿光发射减弱且红色发射增强。以上结果表明，在细胞内lzd在可以对酪氨酸酶进行双通道内源性检测。
18、本专利技术通过近红外双通道荧光检测，以实现对细胞中酪氨酸酶荧光成像。具有稳定的荧光成像能力，细胞毒性测试表明lzd的细胞相溶性良好，共聚焦荧光显微成像实验表明lzd可以双通道对酪氨酸酶进行荧光成像。
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1.一种检测酪氨酸酶的双通道近红外比率荧光探针，其特征在于其结构如下所示：
2.一种权利要求1所述双通道近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
3.权利要求1所述双通道近红外比率荧光探针的用途，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种检测酪氨酸酶的双通道近红外比率荧光探针，其特征在于其结构如下所示：
2.一种权利要求1所述双通道近红外比率荧光探针的制备方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈曼，赵文豪，姚鹏来，冯燕，孟祥明，王宬元，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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