【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因编辑，具体涉及一种pgc-1α基因敲除小鼠构建心律失常动物模型的方法及其应用。
技术介绍
1、心律失常是指心脏冲动的频率、节律、起源部位、传导速度或激动次序的异常，是临床上极为常见的一种疾病，是心源性猝死(sudden cardiac death，scd)的主要原因之一。心律失常发作的原因，主要分为遗传性和后天获得性两种。遗传性心律失常，多数是由基因突变导致的离子通道病，使得心肌细胞离子流发生异常。后天获得性，与运动、情绪变化的生理性因素，及心脏本身、全身性和其他器官障碍导致的病理性因素有关。心律失常导致的scd可占所有死亡的25％，可通过药物治疗、心脏电复律治疗或者手术治疗，但我国scd发生率为41.84/10万，每年猝死人数达54.4万例，居世界首位，疾病负担严重。目前常用的模型有缓慢性心律失常模型、快速性心律失常模型、心房扑动和颤动性心律失常模型、心室心动过速和心室颤动性心律失常模型、房室传导阻滞和房室交接区传导常性心律失常模型、窦房结心律失常模型，但是利用crispr/cas9系统条件性敲除过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(pgc-1α)基因鼠构建心律失常动物模型尚未临床应用。
2、动物模型基因编辑技术主要分为两类：es细胞打靶技术和crispr/cas9技术。其中es细胞打靶是在小鼠胚胎干细胞(es细胞)中进行dna同源重组，将es细胞重新注射到囊胚腔中形成嵌合胚胎，在假孕小鼠体内发育成嵌合体小鼠。嵌合体小鼠再与野生型小鼠交配，从而将es细胞中的遗传信息传递给后代小鼠。其优点是精
3、pgc-1α是近年来备受关注的核受体辅助激活因子，通过与ppars,nrfs和errs等核受体相互作用，调节线粒体的生物合成，物质和能量代谢以及抗氧化应激，在线粒体的生物合成、骨骼肌纤维类型转换、机体适应性产热、糖代谢以及脂代谢中发挥重要作用，涉及到心肌肥厚，心力衰竭，心肌病，动脉粥样硬化以及心肌缺血等心血管疾病的病理生理过程。动物模型是开发新药物及新疗法的重要基础，好的动物模型可以为进一步研究心律失常的发病机制及评价治疗手段的效果等临床研究提供良好的平台。
4、有鉴于pgc-1α在心血管疾病病理生理过程扮演的重要角色，本专利技术针对上述现有技术不足的改进技术方案，提供一种pgc-1α基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种pgc-1α基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供一种pgc-1α基因敲除小鼠构建心律失常动物模型的方法，包括步骤：
4、(1)合成pgc-1α基因的特异性靶位点grna：
5、所述grna包括反链序列和正链序列；所述反链序列的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述正链序列的核苷酸序列如seq id no:2所示；
6、(2)构建靶向载体donor vector：donor vector的核苷酸序列如seq id no:9所示；
7、(3)显微注射：将cas9 mrna、grna的反链序列、grna的正链序列和靶向载体donorvector混匀，得到注射复合物，显微注射入小鼠受精卵中，培育并传代，获得pgc-1α基因敲除的小鼠动物模型。
8、优选的，所述pgc-1α基因的gene id：19017。
9、优选的，所述靶位点grna位于pgc-1α基因的第4-5外显子。
10、优选的，所述传代的具体方法为：1)提取f0代小鼠尾部dna，经pcr鉴定得到阳性小鼠，与野生型异性小鼠交配，获得f1代小鼠；2)提取f1代小鼠尾部dna，经pcr鉴定得到基因型为pgc-1αflox+/-的小鼠，与野生型异性小鼠交配，获得f2代小鼠；3)从f2代小鼠中选取pgc-1αflox+/-小鼠，pgc-1αflox+/-小鼠相互近交产生f3代，得到稳定的pgc-1αflox+/+小鼠品系；4)pgc-1αflox+/+小鼠与不同种类cre鼠杂交得到条件性敲除鼠。
11、优选的，野生型小鼠为野生型c57bl/6小鼠；
12、优选的，f0代小鼠或f1代小鼠pcr鉴定涉及的引物序列包括pcr引物1和pcr引物2；所述pcr引物1上游引物的核苷酸序列如seq id no:11所示；所述pcr引物1下游引物的核苷酸序列如seq id no:12所示；所述pcr引物2上游引物的核苷酸序列如seq id no:13所示；所述pcr引物2下游引物的核苷酸序列如seq id no:14所示。
13、优选的，f2代小鼠或f3代小鼠pcr鉴定涉及的引物序列包括上游引物f4和下游引物r4；所述上游引物f4的核苷酸序列如seq id no:21所示；所述下游引物r4的核苷酸序列如seq id no:22所示。
14、优选的，步骤4)条件性敲除鼠pcr鉴定涉及的引物序列包括上游引物myh6-cre-m-f和下游引物myh6-cre-m-r；所述上游引物myh6-cre-m-f的核苷酸序列如seq id no:23所示；所述下游引物myh6-cre-m-r的核苷酸序列如seq id no:24所示。
15、本专利技术提供一种所述方法获得的pgc-1α基因敲除小鼠动物模型在研究线粒体损伤导致的疾病中的应用。
16、本专利技术提供一种所述方法获得的pgc-1α基因敲除小鼠动物模型在制备抗心律失常的药物中的应用。
17、有益效果：
18、本专利技术设计的grna可以显著提高基因组编辑的特异性，无脱靶效应；cko区域选择小鼠模型pgc-1α基因外显子4～5作为cko区域，导致转录出来的转录本下游开放阅读框架移位，删除此区域将导致小鼠pgc-1α基因功能丧失，达到基因敲除的实验效果，其成本较低、成功率高，实用性大；本专利技术构建的donor vector与grna和cas9mrna显微注射到受精卵中后，可以通过同源重组方式，与靶位点发生高效率的同源重组，使得dna大片段敲入及条件性敲除pgc-1α得以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PGC-1α基因敲除小鼠构建心律失常动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PGC-1α基因的Gene ID：19017。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶位点gRNA位于PGC-1α基因的第4-5外显子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传代的具体方法为：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，野生型小鼠为野生型C57BL/6小鼠。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，F0代小鼠或F1代小鼠PCR鉴定涉及的引物序列包括PCR引物1和PCR引物2；
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，F2代小鼠或F3代小鼠PCR鉴定涉及的引物序列包括上游引物F4和下游引物R4；
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)条件性敲除鼠PCR鉴定涉及的引物序列包括上游引物Myh6-Cre-M-F和下游引物Myh6-Cre-M-R；
9.如权利要求1-8任一项所述方法获得的PGC-1α基因敲除小鼠动物模型在研究
10.如权利要求1-8任一项所述方法获得的PGC-1α基因敲除小鼠动物模型在制备抗心律失常的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种pgc-1α基因敲除小鼠构建心律失常动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pgc-1α基因的gene id：19017。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶位点grna位于pgc-1α基因的第4-5外显子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传代的具体方法为：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，野生型小鼠为野生型c57bl/6小鼠。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，f0代小鼠或f1代小鼠pcr鉴定涉及的引物序列包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：林飞，孙四玉，李雪芳，李东旭，王秀珑，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：
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