【技术实现步骤摘要】
本专利技术基因工程，具体涉及一种门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法和高效表达的筛选及其在赖精胰岛素表达中的应用。
技术介绍
1、胰岛素的发展已经有了百年的历史，随着dna重组技术和蛋白质工程的发展，1982年首个基因工程生产的人胰岛素获得批准使用，克服了动物胰岛素与人胰岛素分子结构不一致，从而减少了免疫原性较高导致的注射部位脂肪萎缩、降糖效果个体差异大、不稳定等问题。在20世纪90年代，科学家对人胰岛素结构和功能进行了深入研究，发现对肽链上的氨基酸进行替换、位点修饰可以改变胰岛素的理化和生物学特征，从而研制出了可模拟生理状态下分泌模式的胰岛素类似物(胰岛素类似体)。这些胰岛素类似物可以改善重组人胰岛素的药代动力学(pk)和药效动力学(pd)特性，使其具有更好的功效和更低的低血糖风险。
2、在重组蛋白表达中，特别是当在细菌中表达真核蛋白时，主要的瓶颈在于蛋白质的正确折叠与可溶性。一些可溶性蛋白已被作为标签用来改善目标蛋白质的折叠。蛋白标签技术是指利用基因克隆手段，将具有特定功能的多肽，蛋白质结构域，甚至完整蛋白质与目标蛋白融合在一起，以实现目标蛋白的表达纯化，检测和示踪等应用的技术。这些标签与其他方法共同使用来促进蛋白质的折叠，如诱导后降低培养温度或者共表达伴侣蛋白，为了获得较高可溶性正确折叠的目标蛋白质，有必要尝试多种可溶性标签。对于那些特别难溶的蛋白质来说，可以尝试在变性的条件下纯化蛋白质，然后再进行重折叠。
3、硫氧还蛋白(trx)是一种热稳定的、12kda大小的大肠杆菌胞内蛋白，该蛋白质很容易过表达，
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法及其应用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是：一种门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，构建含有门冬胰岛素原基因的表达载体，使用融合蛋白超氧化歧化酶sod作为蛋白n端，通过精氨酸链接门冬胰岛素b链，c肽使用赖氨酸和精氨酸链接门冬胰岛素a链，参照门冬胰岛素类似物的氨基酸序列结合大肠杆菌嗜好密码子进行优化设计基因并进行了过程的优化，筛选出高效表达菌株。
3、优选的技术方案为：合成含有门冬胰岛素的前体，即sod门冬胰岛素前体；sod门冬胰岛素前体序列为：
4、atggctaccaaagccgtgagtgttctgaaaggcgatggtccggtgcagggtattattaattttgaacagaaagagagcaacggtccggttaaagtttggggtagtattaagggcctgaccgaaggtctgcatggttttcatgttcatgaaccgcgctttgtgaatcagcatctgtgcggtagtcatctggtggaagccctgtatctggtttgtggtgaacgcggtttcttttataccgataaaaccaaacgcggcattgtggaacagtgttgtaccagtatttgtagtctgtatcagctggaaaattattgcaat。
5、优选的技术方案为：包括下列步骤：
6、步骤1：合成目的基因，即sod门冬胰岛素前体；
7、步骤2：将合成的目的基因进行pcr扩增和回收；
8、步骤3：使用限制性内切酶ndei和blpi对pcr产物及表达载体pet24a(+)分别酶切和回收，获得大量表达片段；
9、步骤4：将回收的目的基因和载体片段纯化后用t4连接酶进行连接，然后转化到大肠杆菌dh5α里面，构建重组工程菌；
10、步骤5：在含有kan的固体lb平板上进行筛选，筛选出单克隆进行培养；
11、步骤6：对培养后的单克隆提取质粒，并进行蛋白表达和测序鉴定。
12、优选的技术方案为：步骤2中，以合成的目的基因为模板，使用上游引物sod-f和下游引物sod-r扩增目的基因片段，扩增的反应体系为50μl，依次加入模板2μl、上游引物sod-f3μl、下游引物sod-r3μl、10×buffer 5μl、dntps 5μl、pfu dna聚合酶2μl和ddh2o 30μl；
13、上游引物sod-f：5’-gcacatatggctaccaaagccgtgagtg-3’；
14、下游引物sod-r：5’-cgtgctcagcttaattgcaataattttc-3’；
15、pcr反应条件：
16、
17、优选的技术方案为：步骤3中，使用限制性内切酶ndei和blpi对pcr产物及载体pet24a(+)分别酶切，酶切反应体系：
18、
19、反应条件为：将反应液混匀，37℃酶切反应1h；吸取双酶切反应产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，在100v条件下电泳50min，紫外灯下观察，切胶回收目的片段。
20、优选的技术方案为：步骤4中，将纯化回收得到的目的基因与pet24a(+)载体进行连接，连接的反应体系：
21、
22、连接条件为22℃连接1h。
23、优选的技术方案为：步骤4中，制备e.coli dh5α感受态，将连接产物取出后转化入e.coli dh5α感受态，在含有kan的固体lb平板上进行筛选，挑取单克隆进行培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒的提取方法按照试剂盒的操作说明进行；并对重组质粒使用相对应的酶进行双酶切，之后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。
24、优选的技术方案为：将构建成功的载体转化大肠杆菌感受态bl21(de3)，经kan抗性筛选，挑取单克隆进行培养，从平板中挑取12个转化子，筛选出表达最高的转化子，通过sds-page电泳验证其蛋白表达情况，选取蛋白表达量高的菌株，再和其他融合标签比较表达强度。
25、由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有的优点是：
26、本专利技术通过目的基因扩增和片段回收、表达载体的构建和序列分析鉴定、融合表达标签的效率比较及高效表达的标签在赖精胰岛素中的表达等一系列步骤筛选出了胰岛素的高效表达蛋白标签pet24a+sod，再根据门冬胰岛素的优化结果，将优化后的高效表达蛋白标签pet24a+sod用于赖精胰岛素的表达筛选，结果发现赖精胰岛素得到高效表达。
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1.一种门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：构建含有门冬胰岛素原基因的表达载体，使用融合蛋白超氧化歧化酶SOD作为蛋白N端，通过精氨酸链接门冬胰岛素B链，C肽使用赖氨酸和精氨酸链接门冬胰岛素A链，参照门冬胰岛素类似物的氨基酸序列结合大肠杆菌嗜好密码子进行优化设计基因并进行了过程的优化，筛选出高效表达菌株。
2.根据权利要求1所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：合成含有门冬胰岛素的前体，即SOD门冬胰岛素前体；SOD门冬胰岛素前体序列为：
3.根据权利要求2所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
4.根据权利要求3所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：步骤2中，以合成的目的基因为模板，使用上游引物SOD-F和下游引物SOD-R扩增目的基因片段，扩增的反应体系为50μL，依次加入模板2μL、上游引物SOD-F 3μL、下游引物SOD-R3μL、10×buffer 5μL、dNTPs 5μL、Pfu DNA聚合酶2μL和ddH2O 30μL；
5.根据权利要求3所述的门冬
6.根据权利要求3所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：步骤4中，将纯化回收得到的目的基因与pET24a(+)载体进行连接。
7.根据权利要求3所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：步骤4中，制备E.coli DH5α感受态，将连接产物取出后转化入E.coli DH5α感受态，在含有Kan的固体LB平板上进行筛选，挑取单克隆进行培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒的提取方法按照试剂盒的操作说明进行；并对重组质粒使用相对应的酶进行双酶切，之后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。
8.根据权利要求3所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：将构建成功的载体转化大肠杆菌感受态BL21（DE3），经Kan抗性筛选，挑取单克隆进行培养，从平板中挑取12个转化子，筛选出表达最高的转化子，通过SDS-PAGE电泳验证其蛋白表达情况，选取蛋白表达量高的菌株，再和其他融合标签比较表达强度。
9.权利要求1-8任一所述的门冬胰岛素融合表达菌株在发酵制备门冬胰岛素中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：构建含有门冬胰岛素原基因的表达载体，使用融合蛋白超氧化歧化酶sod作为蛋白n端，通过精氨酸链接门冬胰岛素b链，c肽使用赖氨酸和精氨酸链接门冬胰岛素a链，参照门冬胰岛素类似物的氨基酸序列结合大肠杆菌嗜好密码子进行优化设计基因并进行了过程的优化，筛选出高效表达菌株。
2.根据权利要求1所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：合成含有门冬胰岛素的前体，即sod门冬胰岛素前体；sod门冬胰岛素前体序列为：
3.根据权利要求2所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
4.根据权利要求3所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：步骤2中，以合成的目的基因为模板，使用上游引物sod-f和下游引物sod-r扩增目的基因片段，扩增的反应体系为50μl，依次加入模板2μl、上游引物sod-f 3μl、下游引物sod-r3μl、10×buffer 5μl、dntps 5μl、pfu dna聚合酶2μl和ddh2o 30μl；
5.根据权利要求3所述的门冬胰岛素融合表达菌株的构建方法，其特征在于：步骤3中，使用限制性内切酶ndei和blpi对pcr产物及载体pet24a(+...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱珠，郑之明，王鹏，赵根海，王丽，王晗，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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