【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及产生和筛选二硫键结合的结合多肽的展示文库的方法，例如以鉴定对靶分子特异性的结合肽。在一些实施方案中，结合肽包含超长cdr3。结合肽可源自包含超长cdr3的牛抗体，或者它们可以是合成的或半合成的。本文还提供了包含二硫键结合的结合多肽的展示文库。本公开还涉及例如使用合适的宿主细胞产生或表达可溶性二硫键结合的结合多肽的方法。本文还提供了包含可溶性二硫键结合的结合多肽的组合物。
技术介绍
1、抗体是脊椎动物免疫系统响应于外源物质(抗原)而形成的天然蛋白质，主要用于防御感染。抗体含有介导与靶抗原结合的互补决定区(cdr)。与其他脊椎动物相比，一些牛抗体具有异常长的可变重链(vh)cdr3序列。这些长cdr3(可长达70个氨基酸)可形成从抗体表面突出的独特结构域，由此允许独特的抗体平台。需要改进的方法来筛选和产生含有长cdr3的抗体或其部分，以及筛选和产生其他二硫键结合的多肽。
技术实现思路
1、在一些实施方案中，本文提供了一种制备牛超长cdr3抗体展示文库的方法，该方法包括：(a)从牛抗体...
【技术保护点】
1.一种制备牛超长CDR3抗体展示文库的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述VL区是BLV1H12 VL区。
3.一种制备牛超长CDR3抗体展示文库的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述cDNA模板文库是从来自免疫牛的外周血单核细胞(PBMC)中分离的RNA制备的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括从来自免疫牛的外周血单核细胞(PBMC)中分离的RNA制备所述cDNA模板文库。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，所述方...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种制备牛超长cdr3抗体展示文库的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述vl区是blv1h12 vl区。
3.一种制备牛超长cdr3抗体展示文库的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述cdna模板文库是从来自免疫牛的外周血单核细胞(pbmc)中分离的rna制备的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括从来自免疫牛的外周血单核细胞(pbmc)中分离的rna制备所述cdna模板文库。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，所述方法还包括用靶抗原使所述牛免疫。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述扩增展示颗粒包括细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、噬菌体展示、mrna展示、核糖体展示或dna展示颗粒。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述扩增展示颗粒是噬菌体展示颗粒。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述扩增展示颗粒是噬菌粒颗粒。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸序列是第一核酸序列，每种可复制表达载体还包含编码噬菌体外壳蛋白的至少一部分的第二核酸序列，并且所述方法还包括用足以产生所述噬菌粒颗粒的量的具有编码所述噬菌体外壳蛋白的基因的辅助噬菌体感染所转化的宿主细胞，由此所述融合蛋白包含噬菌体外壳蛋白的所述至少一部分。
11.一种制备牛超长cdr3抗体噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述blv1h12λvl区在seq id no:2中示出。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述blv1h12λvl区是blv1h12的λvl区的人源化变体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述人源化变体包含基于kabat编号的氨基酸置换s2a、t5n、p8s、a12g、a13s和p14l、cdr1区中的氨基酸置换i29v和n32g和/或cdr2区中的dnn至gdt的氨基酸取代中的一者或多者。
15.根据权利要求13或权利要求14中任一项所述的方法，其中所述人源化变体包含seqid no:107中所示的序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述扩增vh区经由肽接头与所述blv1h12λvl区间接接合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肽接头是(gly4ser)3(seq id no:94)。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中用包含seq id no:84中所示序列的正向引物和包含seq id no:85中所示序列的反向引物从所述cdna模板文库扩增所述ighv1-7家族的所述多种vh区。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在所述构建之前，所述方法还包括对编码所述多种扩增vh区的所述序列进行大小分离以富集具有超长cdr3的vh区。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述大小分离通过凝胶电泳进行。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述凝胶电泳使用1.2％、1.5％或2％琼脂糖凝胶进行，任选地使用2％琼脂糖凝胶进行。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述大小分离包括从编码所述多种扩增vh区的所述序列中分离长度为、约为或大于550个碱基对的序列，其中所述长度为、为约或大于550个碱基对的序列包括编码具有超长cdr3的vh区的序列。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中至少或至少约20％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的所述扩增颗粒展示包含含有超长cdr3区的vh区的scfv。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中至少或至少约30％的所述扩增颗粒展示包含含有超长cdr3区的vh区的scfv。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中至少或至少约40％的所述扩增颗粒展示包含含有超长cdr3区的vh区的scfv。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中至少或至少约50％的所述扩增颗粒展示包含含有超长cdr3区的vh区的scfv。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3是包含半胱氨酸基序的25-70个氨基酸的肽序列，所述半胱氨酸基序包含能够形成1-6个二硫键的2-12个半胱氨酸残基。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3的长度为40至60个氨基酸。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3的长度为至少42个氨基酸。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3的长度为42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸或60个氨基酸。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3包含至少4个半胱氨酸残基。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3包含4个半胱氨酸残基。
33.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3包含6、8、10或12个半胱氨酸残基。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3具有至少2个二硫键。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3具有2个二硫键。
36.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述超长cdr3具有3、4或5个二硫键。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括鉴定所述scfv序列中的cdr3-旋钮序列。
38.一种制备超长cdr3-旋钮展示文库的方法，所述方法包括：
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述cdna模板文库是从来自免疫牛的外周血单核细胞(pbmc)中分离的rna制备的。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，所述方法还包括从来自免疫牛的外周血单核细胞(pbmc)中分离的rna制备所述cdna模板文库。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，所述方法还包括用靶抗原使所述牛免疫。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述扩增展示颗粒包括细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、噬菌体展示、mrna展示、核糖体展示或dna展示颗粒。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述扩增展示颗粒是噬菌体展示颗粒。
44.根据权利要求38-43中任一项所述的方法，其中所述扩增展示颗粒是噬菌粒颗粒。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸序列是第一核酸序列，每种可复制表达载体还包含编码噬菌体外壳蛋白的至少一部分的第二核酸序列，并且所述方法还包括用足以产生所述噬菌粒颗粒的量的具有编码所述噬菌体外壳蛋白的基因的辅助噬菌体感染所转化的宿主细胞，由此所述融合蛋白包含噬菌体外壳蛋白的所述至少一部分。
46.一种制备超长cdr3-旋钮噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：
47.根据权利要求38-46中任一项所述的方法，其中所述引物包含seqid no:7-11和121-130中所示序列中的任一种或由其组成，任选地包含seq id no:123、127和128中所示序列中的任一种或由其组成。
48.根据权利要求38-47中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从所述牛抗体可变重(vh)链模板序列中鉴定所述cdr3-旋钮。
49.根据权利要求37或权利要求48所述的方法，其中所述cdr3-旋钮是通过算法从抗体序列中鉴定的，所述算法包括：
50.根据权利要求49所述的抗体，其中所述抗体序列是牛抗体。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中与所鉴定的序列相比，所鉴定的cdr3-旋钮在n和/或c末端延伸一个、两个、三个、四个或五个氨基酸。
52.根据权利要求38-51中任一项所述的方法，其中所述多种仅cdr3-旋钮抗体中的每一种包含具有半胱氨酸基序的25-70个氨基酸的肽序列，所述半胱氨酸基序包含能够形成1-6个二硫键的2-12个半胱氨酸残基。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述肽序列的长度为40至60个氨基酸。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的方法，其中所述肽序列的长度为至少42个氨基酸。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述肽序列的长度为42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸或60个氨基酸。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述肽序列包含至少4个半胱氨酸残基。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述肽序列包含4个半胱氨酸残基。
58.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述肽序列包含6、8、10或12个半胱氨酸残基。
59.根据权利要求52-58中任一项所述的方法，其中所述肽序列具有至少2个二硫键。
60.根据权利要求52-59中任一项所述的方法，其中所述肽序列具有2个二硫键。
61.根据权利要求52-59中任一项所述的方法，其中所述肽序列具有3、4或5个二硫键。
62.根据权利要求6-37和41-61中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是无毒细菌、病毒、病毒蛋白、免疫调节蛋白、癌抗原、人igg或它们的重组蛋白。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中使用igm、iga和igg特异性引物库合成所述cdna模板文库，所述引物库包含含有seq id no:4中所示序列或由其组成的引物、含有seq id no:5中所示序列或由其组成的引物、含有seq id no:3中所示序列或由其组成的引物和含有seq id no:6中所示序列或由其组成的引物。
64.一种制备超长cdr3-旋钮展示文库的方法，所述方法包括：
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述扩增展示颗粒包括细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、噬菌体展示、mrna展示、核糖体展示或dna展示颗粒。
66.根据权利要求64或权利要求65所述的方法，其中所述扩增展示颗粒是噬菌体展示颗粒。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述扩增展示颗粒是噬菌粒颗粒。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述核酸序列是第一核酸序列，每种可复制表达载体还包含编码噬菌体外壳蛋白的至少一部分的第二核酸序列，并且所述方法还包括用足以产生所述噬菌粒颗粒的量的具有编码所述噬菌体外壳蛋白的基因的辅助噬菌体感染所转化的宿主细胞，由此所述融合蛋白包含噬菌体外壳蛋白的所述至少一部分。
69.一种制备超长cdr3-旋钮噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：
70.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述多种cdr3-旋钮抗体中的至少一种是通过算法从抗体序列中鉴定的，所述算法包括：
71.根据权利要求70所述的抗体，其中所述抗体序列是牛抗体。
72.根据权利要求70或权利要求71所述的方法，其中与所鉴定的序列相比，所述至少一种cdr3-旋钮抗体具有在n和/或c末端延伸一个、两个、三个、四个或五个氨基酸的序列。
73.根据权利要求27-37和52-72中任一项所述的方法，其中所述肽序列包含上行茎结构域和下行茎结构域，其中所述半胱氨酸基序在所述上行茎结构域与所述下行茎结构域之间。
74.根据权利要求64-73中任一项所述的方法，其中所述肽序列从来自用靶抗原免疫的牛的dna扩增。
75.根据权利要求74所述的方法，其中使用对牛超长cdr3区的茎结构域的任一侧特异性的引物从来自所述免疫牛的可变重链cdna文库扩增所述肽序列。
76.根据权利要求27-37、52-72、74和75中任一项所述的方法，其中所述肽序列不包含所述半胱氨酸基序的n-末端的上行茎结构域。
77.根据权利要求27-37、52-72和74-76中任一项所述的方法，其中所述肽序列不包含所述半胱氨酸基序的c末端的下行茎结构域。
78.根据权利要求73-75和77中任一项所述的方法，其中所述上行茎结构域包含序列cx2tvx5q，其中x2和x5是任何氨基酸。
79.根据权利要求78所述的方法，其中x2是ser、thr、gly、asn、ala或pro，并且x5是his、gln、arg、lys、gly、thr、tyr、phe、trp、met、ile、val或leu。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中x2是ser、ala或thr，并且x5是his或tyr。
81.根据权利要求64-73和76-80中任一项所述的方法，其中所述肽序列是合成的cdr3-旋钮。
82.根据权利要求64-73和76-81中任一项所述的方法，其中所述肽序列是环肽或经修饰的环肽。
83.根据权利要求64-73和76-81中任一项所述的方法，其中所述肽序列是源自牛cdr3-旋钮的半合成cdr3-旋钮。
84.根据权利要求64-83中任一项所述的方法，其中所述肽序列的长度为40至60个氨基酸。
85.根据权利要求64-84中任一项所述的方法，其中所述肽序列的长度为至少42个氨基酸。
86.根据权利要求64-85中任一项所述的方法，其中所述肽序列的长度为42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸或60个氨基酸。
87.根据权利要求64-86中任一项所述的方法，其中所述肽序列包含至少4个半胱氨酸残基。
88.根据权利要求64-87中任一项所述的方法，其中所述肽序列包含4个半胱氨酸残基。
89.根据权利要求64-87中任一项所述的方法，其中所述肽序列包含6、8、10或12个半胱氨酸残基。
90.根据权利要求64-89中任一项所述的方法，其中所述肽序列具有...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·麦克格力戈尔，黄芮祺，G·瓦内尔简金斯，V·斯密德，
申请(专利权)人：应用生物医学科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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