【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于有效且充分表达转基因的启动子序列并且涉及包含所述启动子序列的基因转移载体，其用于基因疗法。特别地，本专利技术涉及为中枢神经系统的病理病症提供基因疗法的慢病毒载体。
技术介绍
1、除其它现象外，神经炎症的特征还在于小胶质细胞激活，其在多种遗传性和获得性神经退行性疾病(包括溶酶体贮积障碍(lsd))的发病机制和进展中发挥着重要作用。基于使用基因修饰的造血干细胞(hsc)治疗这些病症的离体基因疗法(gt)的有益效果依赖于来源于移植的转基因hsc的小胶质细胞功能等效细胞植入受体的中枢神经系统(cns))，在那里它们发挥稳态和清除功能，使小胶质细胞稳态正常化并减少治疗后的神经炎症。此外，在用于lsd的hsc gt中，具有酶活性、经过基因校正的移植来源的小胶质细胞样细胞会释放治疗因子(对于每种lsd感兴趣的缺陷性溶酶体酶)，可供所有驻留cns细胞使用。同样，可以探索小胶质细胞介导的免疫调节因子或其它抗氧化因子的递送，以减轻神经炎症和神经变性。
2、用于神经退行性疾病的这种gt策略的理想慢病毒载体(lv)应驱动hspc来源的小胶质细胞样细胞中治疗性转基因的受调控表达：在神经炎症存在时上调，并且在cns稳态条件下下调。这种转录模式是人类hla-dra基因典型的，该基因编码组织相容性白细胞抗原的ii类主要组织相容性复合物(mhc-ii)α链免疫球蛋白结构域。ii类分子由专业抗原呈递细胞(如小胶质细胞)以低基础水平组成型表达，并且它们的表达在炎症期间强烈上调(jennypan-yun ting et al.cell 2
3、然而，仍然需要开发允许转基因有效且充分表达的启动子序列、基因转移载体、逆转录病毒、特别是慢病毒载体。
技术实现思路
1、本专利技术提出并解决的技术问题是提供启动子序列，其允许有效控制转基因的表达，特别是在免疫细胞类型中，例如源自于hsc移植的相关cns相关骨髓/小胶质细胞样细胞中。这样的问题通过根据本专利技术权利要求1的启动子序列得以解决。
2、在对内源人hla-dra基因的推定调控区域进行广泛分析后，本专利技术的作者特别设计了合成启动子，其目的在于具有最小的基础转录活性并且在小胶质细胞活化时高度可诱导。为了公开控制这种转录模式的调控元件，专利技术人通过整合由broad institute-encodeproject在人类造血(k562细胞)和非造血细胞系中产生的公开可用的转录和表观遗传数据，分析了人类hla-dra基因的推定调控区域。通过对人类hla-dra转录起始位点上游和下游基因组区域进行深入的计算机分析，他们确定了表观遗传标记为活性启动子和活性增强子的区域，如chip-seq基因组图谱所示，这些区域与造血特异性转录因子结合。rna-seq数据证实了表观遗传学鉴定的启动子区域。
3、一旦鉴定出广泛的推定启动子区域，专利技术人就通过搜索已知调控ii类基因表达的通用(tata框)和特定dna基序(beresford g.w,nat immunol 2001)对其进行了细化，如：i)w/s-x1-框，充当多组分转录因子rfx的结合位点，rfx招募主要的mhc ii主调控因子，即ii类转录激活因子(ciita)；ii)x2-和y-框，充当x2bp和nf-y转录因子的结合位点。
4、这种计算机分析是使用基于基序的序列分析软件(the meme suite,bailey tl等人,nucleic acids res.2015)进行的，使用beresford等人(beresford g.w,nat immunol2001)发表的s-、x-和y-框序列作为参考。由此鉴定了推定的hla-dra核心启动子区域并将其适应慢病毒系统以生成最终的合成hla-dra启动子(以下称为hhla)。因此，本专利技术的基于hla-dra的启动子被设计为具有紧凑的尺寸，适合于慢病毒系统。
5、如本说明书实验部分报道的结果清楚地证明，由本专利技术的作者设计和开发的新型hhla启动子，当插入慢病毒载体中以控制给定转基因在免疫细胞类型中的表达时，能够在体外和体内mrna和蛋白质水平诱导基因表达，也在来源于hsc移植的相关cns相关骨髓/小胶质细胞样细胞中诱导基因表达。
6、在一个实施方案中，本专利技术的启动子序列被合成并克隆在标准lv骨架中以控制生物无活性报告基因绿色荧光蛋白(gfp)的表达，从而产生报告lv。此类载体目前正在进行临床前研究，并被证明能够以非常高的感染滴度生产，在体外高效且安全地转导人类细胞系和原代造血干细胞/祖细胞(hspc)，并在野生型小鼠中进行的移植试验中，在体内转导并驱动高转基因表达水平的长期再生hsc。
7、目前正在人小胶质细胞中研究本专利技术的启动子序列响应免疫细胞激活而增加其转录水平的能力。值得注意的是，本专利技术的新hhla启动子可以在源自于移植的hspc的骨髓/小胶质细胞中诱导体内高转基因表达，这表明它能够在多能细胞分化为小胶质细胞时维持正确的调控模式，而不会受到表观遗传沉默或其它形式的不良调控。
8、这种类型的启动子对于在神经炎症的存在下需要治疗性蛋白质的基础表达水平增加的细胞和基因疗法方法非常有益，神经炎症是儿童期和成年期多种遗传性或获得性严重神经退行性疾病的典型病理状态。
9、因此，本专利技术的作者获得的结果强烈支持这种新的hhla启动子用于治疗性目的，以确定治疗性分子或免疫调节分子在治疗cns病理病症的基因和细胞治疗方法中的受调控表达，特别是对于以神经炎症为特征的那些。
10、因此，其构成本专利技术的一部分：
11、-启动子序列，其包含具有seq id no:1或与seq id no:1的序列具有超过90％、优选地超过95％、更优选地超过99％同一性的多核苷酸序列，或由这样的多核苷酸序列组成；
12、-基因转移载体，特别是慢病毒载体，其包含根据本说明书和权利要求1中定义的任何实施方案的启动子序列；
13、-病毒载体颗粒，其包含根据本说明书和权利要求中定义的任何实施方案的启动子序列或载体；
14、-分离的宿主细胞，其包含根据本说明书和权利要求中定义的任何实施方案的启动子序列、或载体、或病毒载体颗粒；
15、-分离的宿主细胞，其感染或转导有根据本说明书和权利要求中定义的任何实施方案的基因转移载体或颗粒；
16、-药物组合物，其包含根据本说明书和权利要求中定义的任何实施方案的基因转移载体、或颗粒、或细胞以及一种或多种赋形剂或稀释剂或运载体；
17、-根据本说明书和权利要求书中定义的任何实施方案的基因转移载体、颗粒、药物组合物、细胞，用于作为药物或疫苗使用，用于在基因疗法中使用，用于在造血干细胞疗法中使用，和/或用于治疗cns的病理病症，特别是以神经炎症为特征的cns的病理病症；
18、-根据本说明书和权利要求书中定义的任何实施方案的基因转移载体或颗粒用于调节宿主细胞中、特别是造血干细胞或造血祖细胞中转基因表达的体外本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种启动子序列，包含具有SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1的序列具有大于99％同一性的多核苷酸序列或由这样的多核苷酸序列组成。
2.一种基因转移载体，包含根据权利要求1所述的启动子序列。
3.根据权利要求2所述的基因转移载体，其中所述载体是病毒或非病毒基因转移载体。
4.根据权利要求2或3所述的基因转移载体，其中所述载体是慢病毒载体或源自慢病毒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因转移载体，包含转基因序列，其中所述转基因序列处于所述启动子序列的转录控制之下。
6.根据权利要求5所述的基因转移载体，其中所述转基因编码酶、参与调节炎症或免疫应答的分子、生长/营养因子或其组合，特别地其中所述酶选自溶酶体酶或催化酶的组。
7.一种病毒载体颗粒，包含根据权利要求1所述的启动子序列或根据权利要求2至6中任一项所述的载体。
8.一种分离的宿主细胞，包含根据权利要求1所述的启动子序列或根据权利要求2至6中任一项所述的载体或根据权利要求7所述的病毒载体颗粒。
9.一种分离的宿主细
10.根据权利要求8或9所述的细胞，所述细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
11.一种药物组合物，包含根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体或根据权利要求7所述的颗粒或根据权利要求8至10中任一项所述的细胞以及一种或多种赋形剂或稀释剂或运载体。
12.根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体、根据权利要求7所述的颗粒、根据权利要求11所述的药物组合物、根据权利要求8至11所述的细胞，用于作为药物或疫苗使用。
13.根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体、根据权利要求7所述的颗粒、根据权利要求11所述的药物组合物、根据权利要求8至11所述的细胞，用于在基因疗法中使用，特别是用于在离体和/或体内基因疗法中使用。
14.根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体、根据权利要求7所述的颗粒、根据权利要求11所述的药物组合物、根据权利要求8至11所述的细胞，用于在造血干细胞疗法中使用。
15.根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体、根据权利要求7所述的颗粒、根据权利要求11所述的药物组合物、根据权利要求8至11所述的细胞，用于治疗CNS的病理病症，特别是以神经炎症为特征的CNS的病理病症。
16.根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体、根据权利要求7所述的颗粒、根据权利要求11所述的药物组合物、根据权利要求8至11所述的细胞，用于治疗选自以下的疾病：溶酶体贮积障碍(LSD)，例如异染性脑白质营养不良(MLD)、球状细胞脑白质营养不良(GLD)、神经节苷脂贮积症GM1、神经节苷脂贮积症GM2、黏多糖贮积症(MPS)和其它LSD、过氧化物酶体障碍，例如X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)、肾上腺脊髓神经病(AMN)和/或成人发病的获得性神经退行性病症，例如阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、多发性硬化症(MS)。
17.根据权利要求2-6中任一项所述的基因转移载体或根据权利要求7所述的颗粒用于调控宿主细胞中、特别是造血干细胞或造血祖细胞中转基因表达的体外用途。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种启动子序列，包含具有seq id no:1或与seq id no:1的序列具有大于99％同一性的多核苷酸序列或由这样的多核苷酸序列组成。
2.一种基因转移载体，包含根据权利要求1所述的启动子序列。
3.根据权利要求2所述的基因转移载体，其中所述载体是病毒或非病毒基因转移载体。
4.根据权利要求2或3所述的基因转移载体，其中所述载体是慢病毒载体或源自慢病毒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因转移载体，包含转基因序列，其中所述转基因序列处于所述启动子序列的转录控制之下。
6.根据权利要求5所述的基因转移载体，其中所述转基因编码酶、参与调节炎症或免疫应答的分子、生长/营养因子或其组合，特别地其中所述酶选自溶酶体酶或催化酶的组。
7.一种病毒载体颗粒，包含根据权利要求1所述的启动子序列或根据权利要求2至6中任一项所述的载体。
8.一种分离的宿主细胞，包含根据权利要求1所述的启动子序列或根据权利要求2至6中任一项所述的载体或根据权利要求7所述的病毒载体颗粒。
9.一种分离的宿主细胞，所述细胞感染或转导有根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体或权利要求7所述的颗粒。
10.根据权利要求8或9所述的细胞，所述细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
11.一种药物组合物，包含根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体或根据权利要求7所述的颗粒或根据权利要求8至10中任一项所述的细胞以及一种或多种赋形剂或稀释剂或运载体。
12.根据权利要求2至6中任一项所述的基因转移载体、根据权利要求7所述的颗粒、根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山德拉·比菲，瓦伦蒂娜·波莱蒂，
申请(专利权)人：帕多瓦大学，
类型：发明
国别省市：
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