【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其是涉及一种高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
1、由微生物合成的槐糖脂是一系列槐糖脂分子组成的混合物，以通过β-1,2糖苷键连接而成的槐糖为亲水基团，以饱和/不饱和的长链ω或ω-1羟基脂肪酸为亲脂基团，两基团通过糖苷键相连，形成既有亲水基又具有疏水基，具备表面活性剂的生物表面活性剂。槐糖脂具有降低表面张力、起泡性、乳化性，以及在高温高盐浓度溶液中仍然能保持很好的表面活性的优点，同时还具备可以被微生物利用和降解的特性。因此，槐糖脂作为生物表面活性剂在日化洗涤、家居护理、美容护肤等行业具有非常大的潜在价值，几年来也受到越来越多的关注。
2、但目前槐糖脂在工业化生产和应用领域还面临很多问题，主要有：1.槐糖脂的生物合成产量还较低，作为清洁剂或化妆品材料，与目前使用的相对廉价的化学合成表面活性剂相比，成本和价格高；2.目前发酵得到的槐糖脂产品其组成成分的化学结构主要是以c18和c16为疏水基团的槐糖脂分子，其表活性质和生物活性仍有一定的局限性。
3、不同分子结构的槐糖脂在表面活性性质和生物活性方面有着不同的表现，而中短链内酯型的槐糖脂无论在表面活性如泡沫性、乳化性和溶解性等还是生物活性如抑制癌细胞生长、抗病毒和抑菌等都有很好地表现。但目前有关中短链内酯型槐糖脂的高效生物合成技术以及应用研究还非常少，严重限制了其应用范围和经济价值的开发。因此，迫切需要开发高产中短链内酯型化学结构的槐糖脂的工程菌，以便研究其特殊的结构和功能之间的关系，提高槐糖脂的应用价值。
4、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株，以缓解中短链内酯型槐糖脂产量低的问题。本专利技术的另一目的还在于提供高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株的构建方法和应用。
2、为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
3、第一方面，提供了一株高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株，所述工程菌株的出发菌株为熊蜂生假丝酵母菌(starmerella bombicola)，所述熊蜂生假丝酵母菌的甲醛脱氢酶fadh基因位点插入内酯化酶sble基因和槐糖脂转运蛋白mdr基因，使fadh基因被敲除。
4、第二方面，还提供了第一方面的高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株的构建方法，包括：构建含有插入片段的载体，然后将载体导入出发菌株中，所述插入片段包括sble基因和mdr基因。
5、第三方面，还提供了一种槐糖脂发酵生产方法，包括使用第一方面的工程菌株发酵底物生产槐糖脂。
6、第四方面，还提供了第一方面的高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株，或第二方面的构建方法，或第三方面的槐糖脂发酵生产方法在制备表面活性剂中的应用。
7、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
8、自然界中的槐糖脂的化学结构主要是由长度为16-18碳的脂肪酸链和一个槐糖分子构成的。微生物对中短链脂肪酸的利用率非常低，因此合成疏水基团为6-12个碳的中短链槐糖脂的量非常少。内脂型槐糖脂具有表面活性剂的一般特性以及抗肿瘤、抗菌和抗炎症等特殊生物学活性，但是由于其溶解性较低，限制了其在洗涤、食品和医药等行业的应用。对于槐糖脂分子，降低其疏水基团碳链的长度可以提高其亲水性。因此，通过本专利技术构建的高产中链内酯型槐糖脂工程菌以及其在发酵合成槐糖脂上的应用可以提高微生物发酵合成中链内酯型槐糖脂的产量，解决现有的内脂型槐糖脂溶解度低、应用受限等问题。
9、本专利技术提供的高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株以熊蜂生假丝酵母菌为出发菌株，在调控脂肪酸β-氧化代谢路径中的fadh基因位点插入带有强启动子的调控酯化反应的sble基因和调控槐糖脂转运的mdr基因，从而实现对fadh基因敲除，对sble和mdr基因过表达。本专利技术提供的高产中短链内酯型槐糖脂工程菌株，分别以月桂酸乙酯(8％)、正庚酸(8％)和正己酸(8％)为疏水底物时，所述工程菌株合成槐糖脂的量显著高于野生菌株，250ml培养基发酵培养条件下，工程菌株合成的总槐糖脂量分别为：8.42g、24.89g、21.00g，野生菌株分别为：5.62g、15.51g、13.66g；工程菌株比野生菌株总槐糖脂产量分别提高了49.8％、60.5％和53.7％，内酯型槐糖脂占比工程菌株为45-60％，野生菌株为20-30％。由于中短链槐糖脂相较于长链槐糖脂疏水基团链短，其溶解性和乳化性能相对增强,并且内脂型槐糖脂相较于酸型槐糖脂具有更好的抗肿瘤、抗菌抗病毒等功能活性，因此，可以被广泛的应用于清洁、化妆品、食品和医药等行业，这使得该专利技术工程菌株成为生产槐糖脂特别是中短链内酯型槐糖脂的优势菌株。
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1.一株高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株的出发菌株为熊蜂生假丝酵母菌(Starmerella bombicola)，所述熊蜂生假丝酵母菌的甲醛脱氢酶FADH基因位点插入内酯化酶SBLE基因和槐糖脂转运蛋白MDR基因，使FADH基因被敲除。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，SBLE基因和MDR基因被强启动子调控表达；
3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，SBLE基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；和/或，MDR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的工程菌株，其特征在于，FADH基因位点插入片段由5’端至3’端依次包括SBLE基因、筛选标记基因和MDR基因；
5.权利要求1～4任一项所述的高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株的构建方法，其特征在于，包括构建含有插入片段的载体，然后将载体导入出发菌株中；所述插入片段包括SBLE基因和MDR基因。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述插入片段带有与FADH基因同源的上游
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，使用电转化将含有插入片段的载体导入熊蜂生假丝酵母菌感受态细胞；
8.槐糖脂发酵生产方法，其特征在于，包括使用权利要求1～4任一项所述的工程菌株发酵底物生产槐糖脂。
9.根据权利要求8所述的槐糖脂发酵生产方法，其特征在于，所述底物包括C6-C12脂肪酸或C6-C12脂肪酸酯；
10.权利要求1～4任一项所述的高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株，或权利要求5～7任一项所述的构建方法，或权利要求8或9所述的槐糖脂发酵生产方法在制备表面活性剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一株高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株的出发菌株为熊蜂生假丝酵母菌(starmerella bombicola)，所述熊蜂生假丝酵母菌的甲醛脱氢酶fadh基因位点插入内酯化酶sble基因和槐糖脂转运蛋白mdr基因，使fadh基因被敲除。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，sble基因和mdr基因被强启动子调控表达；
3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，sble基因的核苷酸序列如seq idno.2所示；和/或，mdr基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的工程菌株，其特征在于，fadh基因位点插入片段由5’端至3’端依次包括sble基因、筛选标记基因和mdr基因；
5.权利要求1～4任一项所述的高产中短链内酯型槐糖脂的工程菌株的构建方法，其特征在于，包括构建含...
【专利技术属性】
技术研发人员：张迷敏，刘杰，叶灿彬，张利萍，陈伟哲，陈玉娥，
申请(专利权)人：广州立白企业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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