温氏附红细胞体的环介导等温扩增检测方法技术

本发明专利技术属于寄生虫分子检测技术领域，具体涉及一种温氏附红细胞体的快速环介导等温扩增检测方法。步骤包括：（１）设计三对特异性引物；（２）提取血液样品总ＤＮＡ；（３）环介导的等温扩增反应和扩增产物分析。在凝胶成相系统上成像观察结果，扩增产物为不同大小区带组成的阶梯式图谱为温氏附红细胞体阳性，或在扩增的最终产物中加入ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ自然光下肉眼观察结果，扩增产物变为黄绿色为温氏附红细胞体阳性，扩增产物为红棕色为温氏附红细胞体阴性。本发明专利技术特异性强，可作鉴别常见血液原虫；灵敏度高，比普通ＰＣＲ敏感性高１０－１００倍；检测简单快速，只需一台水浴锅１小时即可出结果。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种适用于温氏附红细胞体的特异性分析的环介导的等温扩增检测方法，其步骤包括：　　（１）引物合成：根据温氏附红细胞体１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列设计三对特异性引物对，所述引物对的ＤＮＡ序列如下所示：　　外引物Ｆ３：５′－ＧＴＴＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＣ－３′；　　外引物Ｂ３：５′－ＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧ－３′；　　内引物ＢＩＰ：５′－ＣＧＣＡＴＴＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣｔｔｔｔＧＣＴＴＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＴ－３′；　　内引物ＦＩＰ：５′－ＡＡＣＡＣＣＡ重组质粒，用ＥｃｏＲ　Ｉ进行酶切鉴定，测序，将测序结果导入ＮＣＢＩ数据库进行序列比对，经确认，得到温氏附红细胞体的阳性质粒。ＧＡＧＧＣＴＡＡＧｔｔＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣ－３′；　　促环引物ＬＦ：５′－ＣＣＴＧＡＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＧ－３′；　　促环引物ＢＦ：５′－ＡＴＡＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＴ－３′。　　（２）牛血样总ＤＮＡ的提取：采用血液／细胞／组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取牛血液样品中总ＤＮＡ；　　（３）环介导的等温扩增：　　１）建立环介导的等温扩增反应体系：２．５μＬ　１０倍体积的Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶缓冲液，其组成成分为０．２ＭＴｒｉｓ－ＨＣＬ，０．１Ｍ　（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］，０．１Ｍ　ＫＣＬ，２０Ｍｍ　ＭｇＳＯ↓［４］，１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，２ｍＭ　ＭｇＣｌ↓［２］，０．６Ｍ甜菜碱，０．４ｍＭ　ｄＮＴＰｓ，外引物Ｆ３Ｂ３各０．０８μＭ，内引物ＦＩＰ　ＢＩＰ各０．６μＭ，促环引物ＬＦ　ＬＢ各０．２８μＭ，８Ｕ　ＢｓｔＤＮＡ聚合酶，５μＬ　ＤＮＡ模板，用灭菌双蒸水补齐至２５μＬ，其中阳性对照为构建好的牛附红细胞体阳性质粒，阴性对照为灭菌双蒸水；　　２）环介导的等温扩增反应：９５℃预变性５ｍｉｎ后加入８Ｕ的Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于６３℃反应５０ｍｉｎ，然后于８０℃作用５ｍｉｎ后终止反应；　　３）扩增产物分析：采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；　　显色反应：将１０００倍体积的荧光显色剂ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ进行１０倍稀释，之后取１－２μＬ加入至２５μＬ的环介导等温扩增的最终产物中，在自然光下用肉眼观察扩增产物的显色情况；　　琼脂糖凝胶电泳：取２５μＬ的环介导等温扩增的最终反应产物１０μＬ，加入至含有０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭染料的２％的琼脂糖凝...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋淇淇，王利霞，赵俊龙，周艳琴，胡敏，贺兰，徐林海，张文杰，张庆丽，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]