【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及具有抗旱作用的烟草内生真菌领域，特别涉及具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-14及其应用。
技术介绍
1、植物内生真菌是一种可以促进植物生长，协助其宿主植物对抗恶劣环境胁迫，产生与宿主植物相类似的次级代谢产物及诱导植物次级代谢产物积累的微生物类群，一般包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。
2、目前，在大量农作物、药用植物和果树等经济作物中已发现超过130种内生细菌，涵盖60个属。常见的内生细菌包括土壤杆菌属(agrobacterium)、肠杆菌属(enterobacter)、芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)、基杆菌属(methylobacterium)和泛菌属(pantoea)以及农杆菌属(agrobacterium),植物内生放线菌的研究上，较多的为弗兰克氏菌属(frankia)，而对于植物内生真菌的研究，大多数是禾本科植物、药用植物、海洋植物等，但烟草方面的还较少。
3、内生菌长期生活在烟草体内，且二者共同进化，已有研究表明，惠非琼等人研究发现，在干旱胁迫下，接种印度梨形孢可使烟草细胞膜损伤程度降低，积累更多的细胞渗透调节物质，同时提高烟草中相关抗旱基因的表达，从而使烟草抗旱能力增强。hamilton等认为内生真菌可以通过改变宿主的抗氧化性来缓解非生物胁迫，在干旱胁迫下，内生真菌定植于宿主中,与宿主植株共生,真菌与植株相互作用，产生生物碱，提高植株的抗氧化性,缓解来自环境中的生物和非生物胁迫。sun等认为在干旱胁迫下，由内生真菌p.indica定殖
4、在我们对云南烟草优势品种云烟87的内生真菌菌群的研究中，共从田间采摘的云烟87烟株中分离出103株内生真菌，共52种，隶属于29个属。其中，上部叶有10个属共11种内生真菌，中部叶有7个属共8种内生真菌，下部叶有6个属共8种内生真菌，茎部有9个属共11种内生真菌，粗根有12个属共21种内生真菌，须根有5个属共7种内生真菌。经筛选，共有1种抗旱内生真菌明显促进了不同烟草品种的烟苗生物量和性状指标。
技术实现思路
1、为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-14及其应用；为提高烟叶的产质量提供新方法。
2、为达到上述目的，本专利技术的技术方案为：
3、具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-14；
4、其特征在于：所述的烟草内生真菌为：毛壳菌属真菌(chaetomium globosum)001i-14；
5、该菌种通过如下步骤获得：
6、a、材料：将从田间采收的云烟87植株分成上部叶、中部叶、下部叶、烟茎、粗根、须根六个部分；
7、b、消毒：上部叶、中部叶、下部叶：75％酒精浸泡30s—0.1％升汞浸泡15s—无菌水冲洗3次；烟茎：75％酒精擦拭表皮-保留皮层及中柱；粗根、须根：75％酒精浸泡60s—0.1％升汞浸泡20s—无菌水冲洗3次，将最后一次冲洗后的无菌水划线于平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底；
8、c、接种分离：将烟叶部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面，全部材料放于28℃恒温培养箱中培养5～7天，观察菌落生长状况；由于不同真菌的繁殖速度不同，优先分离纯化生长较快的菌株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化。
9、进一步地，所述培养基中，固体培养：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)(46g/l)，加入链霉素(10mg/l)，防止细菌滋生，培养温度28℃，培养时间5～7天；
10、将分离出的不同种类的内生真菌接入pda培养基进行纯化，2～3次点接纯化直到菌落单一，筛选后得到1株具有抗旱作用的功能性内生真菌。
11、进一步的，用真菌通用引物its1/its4对菌株进行rdnaits的pcr扩增，并对itspcr扩增产物进行测序，将所得序列在genbank核酸序列数据库中进行blast搜索，毛壳菌属真菌(chaetomium globosum)001i-14发现测试菌株的its区域分别与已报道的同源性最高，结合形态学鉴定，确定1株内生真菌的菌种。
12、所述烟草内生真菌为：
13、毛壳菌属真菌(chaetomium globosum)001i-14，在基物上生长的菌落呈墨绿色的绒状。菌丝白色，生长迅速，扩散快。
14、进一步地，所述烟草内生真菌001i-14菌液的制备方法为：将所述的毛壳菌属真菌001i-14接入液体培养基，摇床震荡培养，转速220rpm，培养温度30℃，培养时间48～72h，备用；液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤，其中马铃薯浸出粉5g/l、葡萄糖20g/l、链霉素10mg/l。
15、具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-14的应用；将其菌液浇施于不同品种烟苗的地上部及根部基质土壤中，从而提高其抗旱性。
16、进一步地，所述的菌液均在烟苗生长出5～6片真叶时施加，两周后检测烟苗的生物量和农艺性状。
17、进一步地，所述的需检测的生物量和农艺性状包括：相对含水量和农艺性状。
18、相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
19、具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-14及其应用，所述真菌接种于红花大金元、云烟87、k326、云烟97四个不同品种的烟苗中，根据对烟苗生物量和农艺性状等7项指标的评判，进一步证实其对烟苗的抗旱作用，为进一步应用于生产提供基础支撑。
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1.具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-14，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-14，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-14，其特征在于：所述内生真菌鉴定具体为：用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行rDNA ITS的PCR扩增，并对ITS PCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索，毛壳菌属真菌(Chaetomium globosum)001I-14发现测试菌株的ITS区域分别与已报道的同源性最高，结合形态学鉴定，确定1株内生真菌的菌种；
4.根据权利要求1所述的具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-14，其特征在于：
5.具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001I-14的应用；其特征在于，将其菌液浇施于不同品种烟苗的地上部及根部基质土壤中，从而提高其抗旱性。
6.根据权利要求5所述应用；其特征在于，所述的菌液均在烟苗生长出5～6片真叶时施加，两周后检测烟苗的生物量和农艺性状。
...【技术特征摘要】
1.具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-14，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-14，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的具有显著抗旱作用的烟草内生真菌001i-14，其特征在于：所述内生真菌鉴定具体为：用真菌通用引物its1/its4对菌株进行rdna its的pcr扩增，并对its pcr扩增产物进行测序，将所得序列在genbank核酸序列数据库中进行blast搜索，毛壳菌属真菌(chaetomium globosum)001i-14发现测试菌株的its区域分别与已报道的...
【专利技术属性】
技术研发人员：宫田睿，郝冰，王慧明，陈小巧，杨景栋，胡浩洋，刘彦中，彭小祠，孙晨，孟金朋，罗杰，杨皓若，杜江顺，康乐怡，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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