【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞在组织修复中的应用，尤其涉及一种动物角膜缘局部损伤模型的构建方法，以利于对角膜干细胞缺乏修复开展医疗研究和医药产品开发。
技术介绍
1、角膜上皮层是角膜的最外层，正常成人角膜上皮大约每3-7天更新一次，该生理性维持过程有赖于位于角膜缘上皮基底层干细胞，即角膜缘干细胞的作用。临床上最多见的角膜化学伤和热烧伤累及角膜缘部位时，可导致角膜缘干细胞损伤，引起角膜缘干细胞缺乏症，会导致角膜上皮正常微环境不能维持，严重降低了健康相关的生活质量。
2、2023年9月18日，国家卫生健康委等6部门联合制定了《第二批罕见病目录》，角膜缘干细胞缺乏症即位列其中。同时，这也是临床难治性眼病，目前常用的角膜缘干细胞移植治疗方法有两大难点，一是手术成功率低，二是缺乏供体来源。因此，一种能够帮助角膜缘干细胞发挥功能，促进角膜上皮创伤修复，恢复角膜上皮稳态的技术方案亟待研究和开发。
3、调节性t细胞(regulatory t cells，treg)是免疫调节细胞，在调控免疫平衡和诱导免疫耐受方面起着重要作用。treg的免疫抑制功能已被广泛认识，并用于治疗自身免疫性疾病，如：多发性硬化和葡萄膜炎等，还应用于器官移植中来提高移植物存活率，如：胰岛移植、肝脏移植和帕金森病细胞移植等。treg不仅在免疫抑制方面具有重要作用，近几年的研究发现，treg还有重要的促进组织修复和再生功能，包括肌肉损伤修复和皮肤损伤修复等。2017年发表于《cell》杂志的文章regulatory t cells in skin facilit
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的在于提供一种调节性t细胞在制备治疗角膜缘损伤药物中应用。
2、本专利技术的另一个目的在于提供一种调节性t细胞在制备治疗角膜缘损伤医疗器械中应用。
3、本专利技术的再一个目的在于提供一种调节性t细胞的制取方法，从外周血单个核细胞来源制得调节性t细胞。
4、一种制取调节性t细胞的方法，包括：
5、将血液(如：外周血或脐血)中分离的单个核细胞进行cd4和cd25标记染色后，经分选(如：但不限于流式分选(美天旎sorter)或磁珠分选)，获得高纯度的调节性t细胞。
6、一种获取单个核细胞的方法，包括：将外周血加入密度梯度分离液，进行密度梯度离心、取中间层，即得外周血单个核细胞。
7、另一种获取单个核细胞的方法，包括：将脐血加入密度梯度分离液，进行密度梯度离心、取中间层，即得脐血单个核细胞。
8、另一种制取调节性t细胞的方法，包括：
9、先取血液(如：外周血或脐血)后，再加入等体积的缓冲液(如：pbs或dpbs)稀释，得到稀释的血液；
10、然后，将稀释的血液缓慢(如：滴加)加入ficoll溶液中(稀释的外周血与ficoll溶液体积比如：2:1)，离心(如：300g，10min)后取中间白色半透明细胞层；
11、接着，向所获取的白色半透明细胞加入缓冲液(如：pbs)稀释(倍数1:10)，继续离心(如：300g，10min)后去上清，用rpmi-1640培养液重悬并进行细胞计数(每50ml外周血所得单核细胞2～5×107)，第三次离心(如：300g，10min)后去上清；
12、之后，每106个细胞，用98μl流式缓冲液(如：macsquant tyto running buffer)重悬细胞，进行cd4和cd25标记染色(如：加入2μl cd25-pe(anti-human)及2μlcd4-vioblue(anti-human)混匀，避光，4℃染色10～15min)；
13、染色完成后，洗涤细胞(如：加入1-2ml tyto running buffer)，第四次离心(如：300g，10min)后弃去上清，将细胞重悬于缓冲液(如：macsquant tyto running buffer，2ml)后过滤(如：孔径20μm滤膜)，所得的细胞溶液经注入流式细胞仪(如：sorter)分选后，获得调节性t细胞。
14、本专利技术的制取调节性t细胞的方法，还包括细胞扩增，利于临床应用和转化。比如：但不限于
15、向每ml扩增培养液(如：texmacs gmp培养液+5％灭活血清+50u/ml青霉素/链霉素+500iu/ml白介素2+200nm雷帕霉素)中加入106个调节性t细胞，再加入treg活化试剂(如：tcell transacttm，10μl/ml扩增培养液)，置于培养箱(如：37℃,5％co2)中培养2-3天初始激活，待细胞明显聚集成簇时，更换培养液，后每2～3天对将原有细胞悬浮液分成两等分分别培养，加入活化试剂的第14天后，得到扩增的treg，作为临床应用。
16、本专利技术制得的treg经体外共培养细胞实验、rna水平转录组测序和构造动物模型体内实验三个层面证实了调节性t细胞对于修复和促进角膜缘干细胞的功能具有巨大作用，比如：treg可以促进角膜缘干细胞发挥功能，验证结膜下注射treg在累及角膜缘的角膜创伤小鼠模型中的治疗效果。
17、外泌体是一类源于内体的细胞外囊泡，其内携带了来自细胞的物质，比如：核酸和蛋白质等物质。本专利技术的调节性t细胞包括treg及其来源于treg的外泌体。
18、本专利技术制得的调节性t细胞作为活性组分，用于治疗角膜缘干细胞缺乏修复药物(如：注射剂或眼药水)或医疗器械(如：敷料、微针或凝胶)，比如：角膜缘干细胞受外界作用而损伤导致的细胞数量减少，或由于年龄增长而导致的细胞数量减少。
19、本专利技术制得的调节性t细胞作为活性组分，用于治疗角膜缘损伤药物(如：注射剂或眼药水)或医疗器械(如：敷料、微针或凝胶)，以利于损伤角膜缘的修复。
20、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
21、本专利技术提供的调节性t细胞的制取方法，其采用从(外周血或脐血来源)单个核细胞获得treg的制备，该方法所提取的细胞由自体来源实现，无免疫排斥，容易本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种调节性T细胞或来源于调节性T细胞的外泌体作为活性组分在制取角膜缘干细胞缺乏修复的药物或医疗器械中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物以调节性T细胞或来源于调节性T细胞的外泌体作为活性组分的注射剂或眼药水。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物以调节性T细胞或来源于调节性T细胞的外泌体作为活性组分的敷料、微针或凝胶。
4.一种调节性T细胞的制取方法，其特征在于包括：
5.根据权利要求4所述的调节性T细胞的制取方法，其特征在于获得所述的单个核细胞的方法包括：将血液加入密度梯度分离液、进行密度梯度离心、取中间层。
6.根据权利要求4所述的调节性T细胞的制取方法，其特征在于
7.根据权利要求4所述的调节性T细胞的制取方法，其特征在于还包括细胞扩增，向每ml扩增培养液中加入106个调节性T细胞，再加入调节性T细胞活化试剂，置于培养箱中培养2-3天初始激活，待细胞明显聚集成簇时，更换培养液，后每2～3天对将原有细胞悬浮液分成两等分分别培养，加入活化试剂的第14天后，得到扩增的
8.根据权利要求7所述的调节性T细胞的制取方法，其特征在于所述的扩增培养液为TexMACS GMP培养液，还含有5％灭活血清、50U/mL青霉素/链霉素、500IU/mL白介素2和200nM雷帕霉素。
9.根据权利要求7所述的调节性T细胞的制取方法，其特征在于每ml所述的扩增培养液加入10μl调节性T细胞活化试剂T Cell TransActTM。
10.根据权利要求1所述的制取方法制得的调节性T细胞作为活性组分在制取角膜缘干细胞缺乏修复的药物或医疗器械中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种调节性t细胞或来源于调节性t细胞的外泌体作为活性组分在制取角膜缘干细胞缺乏修复的药物或医疗器械中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物以调节性t细胞或来源于调节性t细胞的外泌体作为活性组分的注射剂或眼药水。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物以调节性t细胞或来源于调节性t细胞的外泌体作为活性组分的敷料、微针或凝胶。
4.一种调节性t细胞的制取方法，其特征在于包括：
5.根据权利要求4所述的调节性t细胞的制取方法，其特征在于获得所述的单个核细胞的方法包括：将血液加入密度梯度分离液、进行密度梯度离心、取中间层。
6.根据权利要求4所述的调节性t细胞的制取方法，其特征在于
7.根据权利要求4所述的调节性t细胞的制取方法，其特征在于还包括细...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵春益，方菲，傅瑶，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：
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