【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法及其应用。
技术介绍
1、膜性肾病(membranous nephropathy，mn)是以肾小球基底膜(gbm)外侧、上皮细胞下免疫复合物沉积伴gbm弥漫增厚为特征的一组疾病。其典型的病理特征为：基底膜异常，免疫荧光igg伴或不伴c3沿基底膜沉积，上皮下电子致密物沉积。原发性mn(pmn)是构成中老年患者肾病综合征的常见疾病，发病高峰年龄为40～60岁。近年来，膜性肾病在国内发病率逐年增加且有年轻化趋势。
2、mn的确切机制虽仍未被阐明，但经过近60年的不懈努力，己确立的经典理论是：肾小球足细胞上的抗原与其特异性抗体结合形成原位免疫复合物，后续激活补体引起损害，是本病发病的必备条件。最近的研究表明，70％的原发性mn患者血清中发现针对足细胞抗原pla2r的自身抗体。目前尚不清楚pla2r抗体如何产生以及原发性mn的始动因素，相应的动物模型也没有被成功建立。此外，大量的研究表明补体复合物c5b～9在mn中的致病作用不通过其细胞溶解作用，而主要通过激活足细胞来表现，包括诱导足细胞产生氧自由基，刺激足细胞产生各种蛋白酶，促进足细胞调亡、脱落等。
3、目前的mn治疗方案主要包括免疫治疗和非免疫治疗。尿蛋白>3.5g/d的患者在评估危险因素后应给予免疫抑制治疗。2012年kdigo指南推荐治疗mn的一线方案为激素联合烷化剂，cni方案为一线替代方案。近年来也有多项研究尝试了不同的免疫抑制剂组合，但2019年kdigo会议进
4、总体而言，目前mn的发病机制和分子病理学变化尚未明确，疾病治疗的有效率仍然维持在50-60％，且对于一线治疗抵抗的患者缺乏足够的备选治疗方案，因此亟需新的作用靶点以推动治疗方案、治疗理念的进步。已有技术多采用单一的转录组学数据研究膜性肾病的发病机制和疾病状态，缺乏多维度数据的相互支持和印证。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现今膜性肾病治疗中药物种类单一，治疗有效率不足，药物副作用严重和有效靶点筛选困难的问题，提供了一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法及其应用。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，包括如下步骤：
4、(1)转录组数据获取：
5、从公共数据库geo中获取膜性肾病患者和健康移植肾的肾小球微阵列数据，下载数据集gse104948中来自欧洲肾cdna库受试者和活体捐赠者的肾小球表达矩阵，筛选出来自膜性肾病患者(n＝21)和健康捐赠者(n＝21)的样本用于后续分析；
6、表达矩阵使用geo数据库提供的注释文件进行probe id-gene symbol转换；
7、从gse171458中获取膜性肾病患者(n＝6)和健康对照受试者(n＝2)肾活检标本的单细胞rna测序数据；
8、(2)差异基因鉴定：
9、使用limma r包对微阵列转录组数据进行归一化和差异分析，log2倍数变化的绝对值(|log2fc|)大于1且p.adj小于0.05的基因被定义为差异表达基因(degs)；差异分析结果由r包ggplot2和complexheatmap进行数据可视化；
10、(3)富集分析：
11、对于微阵列数据差异分析得到的基因列表，在kobas网页工具中进行在线分析，使用r包clusterprofiler对单细胞rna测序拟时序分析产生的基因列表进行富集分析；
12、r包fgsea被用于单细胞rna测序的基因集富集分析，通过该包计算归一化后的富集分数(nes)和p值并进行可视化，从ferrdb v2数据库获取铁死亡驱动剂的基因集；
13、(4)免疫浸润分析：
14、采用cibersort反卷积算法处理归一化后的肾小球微阵列表达矩阵，预测出正常和膜性肾病肾小球组织中各类免疫细胞的比例；
15、具体而言，使用lm22特征矩阵和1000排列计数进行预测，执行分位数归一化并且仅保留预测结果p<0.05的样本进行后续分析；
16、为保留的样本绘制每种免疫细胞所占比例在mn和健康组的箱线图，通过wilcox秩和检验比较其组间差异，使用spearman相关性系数评估特定细胞因子表达与免疫浸润间的相关性；
17、(5)olink蛋白组学分析：
18、olink标准差异分析使用student test检验计算实验不同条件下标准化npx数据的蛋白的表达差异，根据p-value<0.05条件筛选得到差异蛋白信息，根据此进行差异蛋白表达分析；
19、(6)单细胞rna测序分析：
20、1)数据处理和降维聚类：
21、使用r软件包seurat从geo数据库中整合并分析6名mn患者和2名健康供者的scrna-seq图谱；
22、经过严格的质量控制将所有细胞的nfeature限制在200～5000个之间，细胞的线粒体基因比例在50％以下，然后对过滤后的数据进行对数归一化；
23、通过seurat函数findvariablefeatures选择降维基因，选择方法为“vst”；
24、基因选择完成后，用scaledata对所有对数归一化表达值进行缩放，在降维过程中，选择前50个主成分(pcs)，随后基于r包harmony矫正了批次效应，使用seurat函数findallmarkers识别每簇细胞的标记；
25、在singler包初始注释的基础上根据cellmarker2.0和panglaodb数据库中记录的标记最终确定细胞类型，基因在不同细胞类型中的平均表达量由averageexpression函数计算，并通过r包heatmap可视化；
26、2)差异细胞类型丰度分析：
27、使用r包milor对单细胞数据进行差异丰度测试；
28、3)拟时序轨迹分析：
29、使用r包monocle分别构建单核/巨噬细胞和内皮细胞的伪时间轨迹；4)细胞通讯分析和代谢分析：
30、使用cellchat分析单细胞转录组的细胞间相互作用，不同细胞簇的代谢通路活性由r包scmetabolism基于vision算法计算；
31、5)高维加权基因共表达网络分析(hdwgcna)
32、使用r包hdwgcna执行高维加权基因共表达网络分析；
33、(7)双向孟德尔随机化：
34、为了估计模块基因表达水平与mn之间的因果效应，使用twosamplemr r包进行了双向mr分析；
35、(8)数据分析：
36、使用r 4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的p值是经过Benjamini-Hochberg矫正得到调整后p值。
3.根据权利要求1所述一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(6)中的操作1)中所述的基因选择完成后，用ScaleData对所有对数归一化表达值进行缩放，在降维过程中，选择前50个主成分PCs，随后基于R包harmony矫正了批次效应，为了便于可视化，使用均匀流形逼近和投影UMAP将细胞映射到二维平面上。
4.根据权利要求1所述一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(6)中的操作2)具体为：
5.根据权利要求1所述一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(6)中的操作3)具体为：
6.根据权利要求1所述一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关
7.根据权利要求1所述一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(7)具体为：
8.一种以铁死亡基因SLC1A5作为膜性肾病治疗靶点的应用，其特征在于，所述的铁死亡基因SLC1A5由遍历权利要求1～7任一项所述的识别流程得到。
...【技术特征摘要】
1.一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的p值是经过benjamini-hochberg矫正得到调整后p值。
3.根据权利要求1所述一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，其特征在于，步骤(6)中的操作1)中所述的基因选择完成后，用scaledata对所有对数归一化表达值进行缩放，在降维过程中，选择前50个主成分pcs，随后基于r包harmony矫正了批次效应，为了便于可视化，使用均匀流形逼近和投影umap将细胞映射到二维平面上。
4.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：凌易，李建中，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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