【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，尤其涉及一种筛选大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点的方法及应用。
技术介绍
1、目前，农业生产中的农田污染依旧威胁着人们的健康与生活，其中，过度使用化学氮是农田污染的主要因素之一，研究筛选低氮耐受能力强的作物基因型，是减少氮肥施用量的有效途径，鉴定作物低氮耐受性的分子生物学机制是中心任务之一。
2、研究发现，谷氨酸合成酶是植物体内氮素同化与循环的关键酶，硝酸盐转运蛋白、氨转运蛋白是调节植物体内不同层次氮转运的关键蛋白。除此之外，转录因子是公认的枢纽因子，科研工作者已研究发现多个转录因子家族，包括mads-box、lbd、nlp、myb、nac、btb和grf，它们均可以参与到调控氮素吸收、运输、同化和氮信号转导等生理代谢过程。鉴于许多转录因子充当着主调节因子和选择基因的角色，所以主效转录因子的鉴定在作物低氮耐受性的遗传改良上具有巨大应用价值。
3、基因组遗传变异是控制基因差异性表达(包括关键转录因子的差异性表达)的基础。有意的基因表达变异(组织表型发生改变)几乎都与基因组遗传因素的变异密切关联。基因组遗传变异众多因素中，表达数量性状位点(expression quantitative traitlocus,eqtl)是一类能够影响基因表达量的遗传位点(大部分都是单核苷酸多态性，snp)，具有一定的生物学意义。且eqtl分析策略能够高通量、高效鉴定受基因组遗传变异调控的有意基因表达变异。
4、大麦是一种耐贫瘠的世界第四大禾谷类粮食作物，大麦也一直被用于植物逆境生物
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种筛选大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点的方法及应用，本专利技术通过以大麦为研究对象，利用eqtl(expression qtl)的分析方法，获得了259个大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种筛选大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点的方法，包括如下步骤：
4、(1)以低氮耐受性材料bi-04为母本，bi-45为父本，杂交，获得f1代植株；
5、(2)采用游离小孢子培养技术处理处于单核靠边期的f1代植株穗，获得125份大麦双单倍体植株；
6、(3)将大麦双单倍体植株处于2～3叶期的幼苗置于营养液中培养，将培养至第4～5叶期的幼苗置于低氮营养液中培养20～30h，获得完整植株；
7、(4)提取植株地下部分的dna，使用限制性内切酶制备80～100bp的片段，pcr扩增，双尾测序，将测序过滤后的reads与大麦参考基因组进行对比分析及鉴定，构建遗传图谱；
8、(5)提取植株地上部分的总rna，构建rna测序文库，进行rna-seq分析，计算基因的rpkm值，若基因的rpkm值>1，则定义为表达基因；
9、(6)以大麦全基因组为参考，对表达基因进行eqtl分析，若eqtl位点与显著性关联的基因的最大距离在eqtl位点上下游5mb的范围内，则定义为顺式调控的基因，若eqtl位点与显著性关联的基因的最大距离超过eqtl位点上下游5mb，则定义为反式调控的基因；采用软件r/qtl软件包对目的基因进行多性状qtl模型分析(p<0.05，lod≥3)，获得大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点。
10、优选的，步骤(2)游离小孢子培养技术包括如下步骤：
11、(a)选取单核靠边期的植株穗，低温处理，消毒，获得预处理植株穗；
12、(b)将预处理植株穗的花药加入提取液中，切割，获得小孢子；
13、(c)使用ems诱变剂暗处理小孢子，纯化，接种于培养皿中暗培养，获得植株体。
14、进一步优选的，步骤(a)所述低温处理的温度为5～8℃，所述低温处理的时间为15～18d，所述消毒处理的溶液为饱和漂白粉溶液，所述消毒处理的时间为15～20min。
15、进一步优选的，步骤(b)所述预处理植株穗的花药与提取液的质量体积比为1g：900～1000ml；所述提取液以水为溶剂，含有50～60ml/l甘露醇、1.0～1.5g/l cacl2、0.970～0.980g/l2-(n-吗啡啉)乙磺酸，所述切割后进行过滤、离心，所述离心的转速为100～150g，所述离心的时间为5～8min，所述离心的次数为2～3次。
16、进一步优选的，步骤(c)所述ems诱变剂为甲磺酸乙酯，所述暗处理的温度为25～30℃，所述暗处理的时间为45～50h，所述纯化的试剂为质量分数为20～25％的麦芽糖，所述暗培养前将小孢子的密度调节至1×105/ml。
17、优选的，步骤(3)所述营养液为1.4～1.5mm的硝酸铵溶液。
18、优选的，步骤(3)所述培养的模式为明暗交替培养，所述明暗交替培养时，暗培养的时间为8～10h，所述明培养的光量子通量密度为300～350μmol/(m2·s)。
19、优选的，步骤(3)所述培养的温度为20±2℃，所述培养的相对湿度为70～80％。
20、优选的，步骤(3)所述低氮营养液为0.2～0.3mm硝酸铵溶液。
21、本专利技术还提供了所述的方法筛选获得的大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点在辅助育种中的应用，所述筛选获得的大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点有259个，分别为chr1_10246388、chr1_11453172、chr1_20346314、chr1_219973153、chr1_24521256、chr1_25108662、chr1_27728982、chr1_27736069、chr1_415041899、chr1_425743701、chr1_426205852、chr1_427925836、chr1_428372574、chr1_433298212、chr1_433300287、chr1_466942720、chr1_469037305、chr1_474502273、chr1_482728881、chr1_488813596、chr1_491738705、chr1_491749080、chr1_491749087、chr1_499396923、chr1_505072054、chr1_524754441、chr1_525074914、chr1_525136132、chr1_525399200、chr1_525564114、chr1_5273829、chr1_528148045、chr1_528148885、chr1_528178322、chr1_539973500、chr1_540657315、chr1_540657388、chr1_540657411、chr1_5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种筛选大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)游离小孢子培养技术包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述低温处理的温度为5～8℃，所述低温处理的时间为15～18d，所述消毒处理的溶液为饱和漂白粉溶液，所述消毒处理的时间为15～20min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述预处理植株穗的花药与提取液的质量体积比为1g：900～1000ml；所述提取液以水为溶剂，含有50～60ml/L甘露醇、1.0～1.5g/L CaCl2、0.970～0.980g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，所述切割后进行过滤、离心，所述离心的转速为100～150g，所述离心的时间为5～8min，所述离心的次数为2～3次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述EMS诱变剂为甲磺酸乙酯，所述暗处理的温度为25～30℃，所述暗处理的时间为45～50h，所述纯化的试剂为质量分数为20～25％的麦芽糖，所
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述营养液为1.4～1.5mM的硝酸铵溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养的模式为明暗交替培养，所述明暗交替培养时，暗培养的时间为8～10h，所述明培养的光量子通量密度为300～350μmol/(m2·s)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养的温度为20±2℃，所述培养的相对湿度为70～80％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述低氮营养液为0.2～0.3mM硝酸铵溶液。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法筛选获得的大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点在辅助育种中的应用，其特征在于，所述筛选获得的大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点有259个，分别为chr1_10246388、chr1_11453172、chr1_20346314、chr1_219973153、chr1_24521256、chr1_25108662、chr1_27728982、chr1_27736069、chr1_415041899、chr1_425743701、chr1_426205852、chr1_427925836、chr1_428372574、chr1_433298212、chr1_433300287、chr1_466942720、chr1_469037305、chr1_474502273、chr1_482728881、chr1_488813596、chr1_491738705、chr1_491749080、chr1_491749087、chr1_499396923、chr1_505072054、chr1_524754441、chr1_525074914、chr1_525136132、chr1_525399200、chr1_525564114、chr1_5273829、chr1_528148045、chr1_528148885、chr1_528178322、chr1_539973500、chr1_540657315、chr1_540657388、chr1_540657411、chr1_540875971、chr1_541351144、chr1_541502722、chr1_541754686、chr1_542137657、chr1_545584312、chr1_546288074、chr1_547521732、chr1_549429913、chr1_549814426、chr1_551867728、chr1_554372256、chr1_554884730、chr1_554884879、chr1_7186925、chr1_7367587、chr1_86722097、chr1_8894575、chr1_8937262、chr1_9045201、chr1_9239780、chr2_11174375、chr2_18767125、chr2_18767951、chr2_18767997、chr2_24236990、chr2_368724198、chr2_40749583、chr2_41951315、chr2_57968782、chr2_59840850、chr2_60371684、chr2_657046451、chr2_657063879、chr2_694178436、chr2_711866384、chr2_841931、chr3...
【技术特征摘要】
1.一种筛选大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)游离小孢子培养技术包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述低温处理的温度为5～8℃，所述低温处理的时间为15～18d，所述消毒处理的溶液为饱和漂白粉溶液，所述消毒处理的时间为15～20min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述预处理植株穗的花药与提取液的质量体积比为1g：900～1000ml；所述提取液以水为溶剂，含有50～60ml/l甘露醇、1.0～1.5g/l cacl2、0.970～0.980g/l 2-(n-吗啡啉)乙磺酸，所述切割后进行过滤、离心，所述离心的转速为100～150g，所述离心的时间为5～8min，所述离心的次数为2～3次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述ems诱变剂为甲磺酸乙酯，所述暗处理的温度为25～30℃，所述暗处理的时间为45～50h，所述纯化的试剂为质量分数为20～25％的麦芽糖，所述暗培养前将小孢子的密度调节至1×105/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述营养液为1.4～1.5mm的硝酸铵溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养的模式为明暗交替培养，所述明暗交替培养时，暗培养的时间为8～10h，所述明培养的光量子通量密度为300～350μmol/(m2·s)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养的温度为20±2℃，所述培养的相对湿度为70～80％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述低氮营养液为0.2～0.3mm硝酸铵溶液。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法筛选获得的大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点在辅助育种中的应用，其特征在于，所述筛选获得的大麦耐受低氮环境的数量性状表达基因座位点有259个，分别为chr1_10246388、chr1_11453172、chr1_20346314、chr1_219973153、chr1_24521256、chr1_25108662、chr1_27728982、chr1_27736069、chr1_415041899、chr1_425743701、chr1_426205852、chr1_427925836、chr1_428372574、chr1_433298212、chr1_433300287、chr1_466942720、chr1_469037305、chr1_474502273、chr1_482728881、chr1_488813596、chr1_491738705、chr1_491749080、chr1_491749087、chr1_499396923、chr1_505072054、chr1_524754441、chr1_525074914、chr1_525136132、chr1_525399200、chr1_525564114、chr1_5273829、chr1_528148045、chr1_528148885、chr1_528178322、chr1_539973500、chr1_540657315、chr1_540657388、chr1_540657411、chr1_540875971、chr1_541351144、chr1_541502722、chr1_541754686、chr1_542137657、chr1_545584312、chr1_546288074、chr1_547521732、chr1_549429913、chr1_549814426、chr1_551867728、chr1_554372256、chr1_554884730、chr1_554884879、chr1_7186925、chr1_7367587、chr1_86722097、chr1_8894575、chr1_8937262、chr1_9045201、chr1_9239780、chr2_11174375、chr2_18767125、chr2_18767951、chr2_18767997、chr2_24236990、chr2_368724198、chr2_40749583、chr2_41951315、chr2_57968782、chr2_59840850、chr2_60371684、chr2_657046451、chr2_657063879、chr2_694178436、chr2_711866384、chr2_841931、chr3_119015145、chr3_28697877、chr3_29177679、chr3_350005398、chr3_350005459、chr3_400732305、chr3_535307765、chr3_535308000、chr3_535347061、chr3_553701184、chr3_567639470、chr3_568150860、chr3_581281647、chr3_607678247、chr3_618407824、chr3_625414704、chr3_635504771、chr3_641852475、chr3_649764241、chr3_650792639、chr3_650792691、chr3_658128606、chr3_673057733、chr3...
【专利技术属性】
技术研发人员：周龙华，郭桂梅，何婷，陈志伟，李颖波，刘成洪，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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