【技术实现步骤摘要】
本申请涉及一种微生物筛选培养方法，具体为一种土壤微生物的原位、无损筛选培养方法。
技术介绍
1、土壤活性微生物在生物地球化学循环过程中发挥着重要作用。获取优质的微生物资源，构筑高效微生物互作体系，对促进农田养分高效利用、提高作物养分获取、提升作物耐受逆境能力(干旱、盐碱、重金属、病虫害等)至关重要，挖掘土壤中有益微生物组也被认为是未来农业可持续发展的重要策略。目前，有研究报道高达99％的土壤微生物尚未实现实验室的纯培养。然而，基于免培养的基因测序法仅能反映微生物的功能潜力，而非真实的代谢功能表型；基于传统的培养方法，在挖掘微生物资源方面，存在三个缺点：1)由于纯培养条件和微生物所处的实际环境差别很大，人为难以模拟复杂的微生物互作体系，使得通过纯培养获得的细菌功能性状不能真实反映其在原位环境中的表型和代谢活性，导致对微生物功能鉴定和活性评估上，存在失真性。2)由于人工培养基与细菌原位生长条件差异大，增加了纯培养的难度，导致仅有少数菌能被分离培养，损失了绝大多数“尚未培养”和进入vbnc状态(活着但不能培养)的微生物，存在片面性。3)由于缺少对目标微生物功能的筛选鉴定，培养出的菌，需要后续通过功能验证进行筛选，即先培养后筛选，过程往往变得耗时耗力，存在盲目性和效率低。目前，有效的微生物资源挖掘技术，仍很欠缺。因此，目前亟待开发一种针对土壤原位活性或功能、无损检测、高通量的土壤微生物筛选和培养方法，利用先筛选后培养，实现对目标土壤微生物的高效分选培养。
技术实现思路
1、本申请旨在至少在
2、在土壤样品中加入染色剂，并将加入所述染色剂的所述土壤样品在第一预设条件下培养；
3、将经所述第一预设条件培养后的土壤样品进行土壤微生物收集；
4、将收集到的土壤微生物在第二预设条件下采用荧光激活分选技术进行目标细胞分选；
5、将所述分选出的目标细胞进行人工培养以获得具有原位高活性的微生物。
6、本专利技术将染料添加到土壤中，具体原理是：在土壤原位环境中，fada探针可以通过细菌转肽酶的作用将带荧光标记的d-丙氨酸结合到新合成的细胞壁肽聚糖上。因此，具有代谢活性的土壤微生物在添加染料后经孵育，能够在流式细胞仪中检测到荧光。该方法可用于识别土壤活性微生物组和具有高代谢活性的微生物。结合荧光激活细胞分选技术，能够将目标微生物分选出来，并进一步通过培养获得单克隆菌株。与现有技术不同的是，本专利技术采用的方法克服了传统培养方法的片面性、盲目性和失真性，能够实现“高通量靶向筛选，后培养”技术流程，具有高通量、原位、稳定、特异性的优势。
7、可选的，所述土壤样品中加入染色剂，包括：将染色剂加入土壤上清液中，使含有染色剂的液面完全覆盖土壤颗粒；所述染色剂为(fam)-amino-d-alanine(fada，羧基荧光素-d-丙氨酸)染料和/或其他带荧光基团的d型丙氨酸或其衍生物。
8、根据本专利技术的实施例，d型氨基酸是细菌细胞壁特有的结构，是细菌代谢标记的天然靶点。相较于核酸标记，目前普遍认为氨基酸标记是表征细胞代谢活性最直接准确的方案。在d型氨基酸侧链添加一个fam荧光基团，就可以在细菌细胞壁合成时实时、快速、特异性地标记活性细菌。此外，由于肽聚糖结构广泛存在于细菌中，申请人通过大量研究发现土壤大多数细菌对fada具有耐受性，fada可以作为针对土壤细菌的专用染色剂；申请人通过大量研究发现，将染料添加到培养基或土壤原位，可对纯培养下以及复杂原位环境中的活性细菌进行特异性标记，具有特异性高、稳定的特点。并且申请人发现，fada本身对细胞没有毒性，整个标记过程也不需要点击反应，因此不存在例如生物正交非标准氨基酸标记(boncat)需要固定杀死细胞的步骤，对细菌的标记是无损的，这为细菌后续的分选培养提供了可能。因此，对于土壤细菌而言，fada染料相比其他染料而言具有不可替代的优势。本申请涉及的土壤微生物原位代谢标记方法，结合细胞分选，可实现对土壤微生物的筛分和培养，相较于目前其它原位标记技术存在的标记混淆、成本高、无法得到活细胞等不足，具有不可替代的优势，该方法为直接评估和挖掘环境中的功能微生物提供了优选方案。
9、可选的，所述第一预设条件包括：fada染色剂的工作浓度100-300μ m，避光且培养24-96小时。
10、根据本专利技术的实施例，申请人通过大量研究发现，染色剂工作浓度为100-300μm时，染色剂对土壤微生物具有较高的标记率，且可以减少细胞对探针的特异性吸附；避光培养预定时间可以避免或减少染料淬灭，提高标记效果，从而保证筛选过程的高效完成。
11、可选的，所述将经所述第一预设培养后的土壤样品进行土壤微生物收集，包括：
12、用碘海醇密度梯度离心法收集细胞，并将收集到的细胞用pbs磷酸盐缓冲液离心洗涤3次去除残留的染料。
13、可选的，所述用碘海醇密度梯度离心法收集细胞，并将收集到的细胞用pbs磷酸盐缓冲液离心洗涤3次去除残留的染料，包括：
14、在第一预设量的土壤样品中加入第二预设量的磷酸盐缓冲液和第三预设量的吐温20表面活性剂以形成待处理样品，将所述待处理样品利用涡旋仪震荡第一预设时间，以分离所述待处理样品中土壤颗粒上附着的细菌；将所述利用涡旋仪震荡第一预设时间后的待处理样品缓慢加入碘海醇溶液中并在第三预设条件下进行离心。需要说明的是，本申请涉及的是土壤微生物的收集，相比动植物细胞而言，土壤样品成分复杂，对于细胞的收集提纯具有较大难度，专利技术人创造性地设计了以上收集方式，该方法能够高效地实现细胞的收集与提纯，减少杂质的干扰。
15、可选的，将高荧光强度的分选细胞稀释后涂布在平板上。在室温下培养2-7天，对人工培养基上生长的单个菌落进行纯化，获得纯净的分离株。可选择的人工培养基包括lb、tsb、nb、r2a、高氏一号培养基等。针对想获得目的细胞的功能性状，也可选择相应的选择培养基培养并鉴定功能。
16、根据本专利技术的实施例，采用上述过程能够在较为简单的条件下保证整个筛选过程的高效进行。
17、所述第一预设量为0.5-1.5g，所述第二预设量为2.5-8ml，所述第二预设量为10-50μl，所述第一预设时间为10-50min，所述第三预设条件为：在5000-1000rpm转速条件下离心30min-70min。
18、根据本专利技术的实施例，传统认知中通过采用过量的染色剂其染色效果越好，事实上，本方法中专利技术人发现，较多的染色剂会导致残留严重，使得后期清洗分离效果较差。
19、采用以上数据进行目标微生物筛选，能够保证染色效果的同时减少试剂的浪费，同时保证清洗分离效果，进而保障筛选效果。
20、可选的，所述将收集到的土壤微生物在第二预设条件下采用荧光激活分选技术进行目标细胞分选，包括：
21、设置流式细胞仪的激发光波长为488nm，选择相应荧光本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种土壤微生物筛选培养方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述土壤样品包括新鲜土壤和/或施加环境限制因子的土壤，所述环境限制因子包括：低有效磷，低有效钾，抗生素，干旱，低温，高温，酸化，铝毒，高有机质负荷，高重金属负荷，高污染物负荷中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述土壤样品中加入染色剂，包括：用加染色剂的无菌水慢慢渗透浸没土壤样品，使含有染色剂的液面完全覆盖土壤颗粒；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一预设条件包括：所述染色剂的工作浓度100-300μ M、避光培养24-96小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将经所述第一预设培养后的土壤样品进行土壤微生物收集，包括：
6.根据权利要求5所述的方案，其特征在于：所述用碘海醇密度梯度离心法收集细胞，并将收集到的细胞用PBS磷酸盐缓冲液离心洗涤3次去除残留的染料，包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述第一预设量为0.5-1.5g，所述第二预设量为2.
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法设置不添加所述染色剂的第一对照土壤样品和经灭活处理的第二对照土壤样品，所述第一预设强度大于所述第一对照土壤样品和所述第二对照土壤样品的荧光强度。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：还包括：
...【技术特征摘要】
1.一种土壤微生物筛选培养方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述土壤样品包括新鲜土壤和/或施加环境限制因子的土壤，所述环境限制因子包括：低有效磷，低有效钾，抗生素，干旱，低温，高温，酸化，铝毒，高有机质负荷，高重金属负荷，高污染物负荷中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述土壤样品中加入染色剂，包括：用加染色剂的无菌水慢慢渗透浸没土壤样品，使含有染色剂的液面完全覆盖土壤颗粒；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一预设条件包括：所述染色剂的工作浓度100-300μ m、避光培养24-96小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将经所述第一预设培养后的土壤样品进行土壤微生物收集，包括：
6.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔丽，丁家治，李弘哲，朱永官，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：
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