【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病原菌分离鉴定，尤其涉及一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法。
技术介绍
1、伞房属是桃金娘科下的一属，通常为乔木，有时灌木，如斑皮桉、大叶斑皮桉、柠檬桉和斑皮柠檬桉4个树种均属于桃金娘科伞房属树种，主要分布于澳大利亚东北，从昆士兰北部延伸至维多利亚东南沿海，这4个树种几乎都是大乔木，树干通直，是重要的用材树种，可用于建筑、家具和造船等，目前对伞房属树种的研究主要集中于系统遗传改良研究，而对伞房属树种新芽枯萎病的研究还较少。
2、对伞房属树种具有典型症状的新芽枯萎病观察发现，嫩枝与嫩叶是最主要的受害部位，嫩叶感病较为严重，感病部位一般为叶片边缘和中间的叶脉，附着有粉状斑白，随后感病部位逐步扩大，并伴随出现叶片的严重卷曲，嫩枝的感病多出现在病害严重的枝条，多为未木质化或半木质化嫩枝，后期叶片感病部位逐渐枯死，叶片的卷曲不可恢复，感病严重的幼树会出现顶冠新枝叶全部枯死，甚至造成整棵幼树的死亡。
3、为了研究伞房属树种新芽枯萎病的致病菌，并针对该病原菌进行生物学特性、致病性、药剂筛选、病害防治和抗病育种等工作，亟需对患有新芽枯萎病的伞房属树种进行病原菌分离鉴定，而现有的一些病原菌分离鉴定方法大都操作复杂，耗时较长，鉴定结果也不够准确，因此，本专利技术提出一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法以解决现有技术中存在的问题。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的在于提出一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，解决现有的一
2、为了实现本专利技术的目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，包括以下步骤：
3、步骤一：先按质量比10:1:1称取马铃薯切块、琼脂和葡萄糖备用，再利用称取的马铃薯切块、琼脂和葡萄糖搭配去离子水配置出培养基混合液并进行灭菌处理，灭菌处理后再将培养基混合液平均倒入各培养皿中水平静置，待各培养皿中的培养基混合液凝固后得到pda平板培养基备用；
4、步骤二：先采集伞房属树种上具有明显新芽枯萎病病症的嫩枝与嫩叶，再采用组织分离法从采集的嫩枝和嫩叶的病害组织上分离出病斑组织，接着将病斑组织放入步骤一中的pda平板培养基上并在恒温环境中培养出菌株备用；
5、步骤三：采用分生孢子单孢分离法对步骤二中培养的菌株进行单孢纯化处理，得到单菌落，接着将单菌落的菌丝挑取至斜面试管培养基中冷藏保存，得到单孢纯化菌株备用；
6、步骤四：先将步骤三中培养得到的单孢纯化菌株转移至pda平板培养基上继续培养，培养到预设时间后采用显微镜观察pda平板培养基上菌落的形态特征以及菌丝的形态特征，观察完毕后划破菌落并取出分生孢子继续用显微镜观察，同时测量分生孢子的大小；
7、步骤五：先提取步骤四中菌丝的dna，再对菌丝中提取的dna进行pcr扩增，以扩增目的片段并对扩增产物进行测序，接着对测序结果进行分析，获得分离物的种属信息，实现病原菌鉴定。
8、进一步改进在于：所述步骤一中，所述培养基的具体配置步骤为：先称取200g去皮后的马铃薯切块放入1000ml的去离子水中蒸煮30min，再将去离子水中的马铃薯切块滤除并得到滤液，接着称取20g琼脂加入滤液中加热融化，随后称取20g葡萄糖加入滤液中继续加热，待葡萄糖完全溶解后滤除滤液中的杂质，然后补充去离子水定容至1000ml制得培养基混合液，之后将培养基混合液分装到三角瓶中进行高压灭菌，灭菌完毕后平均倒入各培养皿中水平静置，待凝固后制得pda平板培养基。
9、进一步改进在于：葡萄糖完全溶解于滤液后调节ph值至5.5～6.5，培养基混合液在三角瓶中分装后完毕后放入高压灭菌锅中以121℃的温度灭菌30min，培养皿在倒入培养基混合液前先进行消毒灭菌处理。
10、进一步改进在于：所述步骤二中，分离病斑组织的具体步骤为：先采用经高温消毒的刀片从采集的嫩枝和嫩叶上切取病健交界处5×5mm大小的病斑组织，接着先后用酒精和升汞溶液对切取的病斑组织进行浸泡。
11、进一步改进在于：对病斑组织浸泡的具体步骤为：先配置浓度为75％的酒精对病斑组织浸泡15s，酒精浸泡完毕后利用无菌水对病斑组织进行清洗，清洗完毕后再配置浓度为0.1％的升汞溶液对病斑组织浸泡45s，升汞溶液浸泡完毕后再次利用无菌水对病斑组织进行清洗。
12、进一步改进在于：所述步骤二中，每组pda平板培养基上放置五组病斑组织，并放入恒温培养箱中以25℃的温度在黑暗环境下培养，待培养出菌落后在菌落边缘挑取菌丝并转移至新的pda平板培养基上培养出菌株。
13、进一步改进在于：所述步骤三中，对菌株进行单孢纯化处理的具体步骤为：先在载玻片上滴加一滴无菌水，接着将步骤二中培养的菌株的分生孢子挑取至载玻片上的无菌水中，使分生孢子在无菌水中均匀分散，得到孢子悬浮液并均匀涂布接种在新的pda平板培养基上进行恒温培养，直至萌发出单菌落。
14、进一步改进在于：所述步骤四中，单孢纯化菌株转移至pda平板培养基上在25℃的黑暗环境下培养60h，菌落的形态特征和菌丝的形态特征包括颜色、光泽度和形状。
15、进一步改进在于：所述步骤五中，对测序结果进行分析的具体步骤为：先利用真菌dna提取试剂盒提取步骤四中菌丝的dna，并采用真菌核糖体基因内转录间隔区通用引物its1和its4对提取的dna进行pcr扩增，以扩增目的片段并对扩增产物进行测序，再将测序结果与genbank中已知种属的序列进行序列比对和同源性分析。
16、本专利技术的有益效果为：本专利技术通过组织分离法从感病植株的嫩叶和嫩枝中分离出真菌并在预先配置的pda平板培养基上培养出菌株，再通过分生孢子单孢分离法对菌株进行单孢纯化处理以获得单孢纯化菌株，从而便于对菌落和菌丝的形态特征进行观测，同时便于进行pcr扩增和测序以获得分离物的种属信息，进而实现对病原菌的快速分离和准确鉴定，相比传统的病原菌分离鉴定方法操作更为简单，效率更高，鉴定结果也更准确。
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1.一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：所述步骤一中，所述培养基的具体配置步骤为：先称取200g去皮后的马铃薯切块放入1000ml的去离子水中蒸煮30min，再将去离子水中的马铃薯切块滤除并得到滤液，接着称取20g琼脂加入滤液中加热融化，随后称取20g葡萄糖加入滤液中继续加热，待葡萄糖完全溶解后滤除滤液中的杂质，然后补充去离子水定容至1000ml制得培养基混合液，之后将培养基混合液分装到三角瓶中进行高压灭菌，灭菌完毕后平均倒入各培养皿中水平静置，待凝固后制得PDA平板培养基。
3.根据权利要求2所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：葡萄糖完全溶解于滤液后调节pH值至5.5～6.5，培养基混合液在三角瓶中分装后完毕后放入高压灭菌锅中以121℃的温度灭菌30min，培养皿在倒入培养基混合液前先进行消毒灭菌处理。
4.根据权利要求1所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：所述步骤二中
5.根据权利要求4所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：对病斑组织浸泡的具体步骤为：先配置浓度为75%的酒精对病斑组织浸泡15s，酒精浸泡完毕后利用无菌水对病斑组织进行清洗，清洗完毕后再配置浓度为0.1%的升汞溶液对病斑组织浸泡45s，升汞溶液浸泡完毕后再次利用无菌水对病斑组织进行清洗。
6.根据权利要求1所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：所述步骤二中，每组PDA平板培养基上放置五组病斑组织，并放入恒温培养箱中以25℃的温度在黑暗环境下培养，待培养出菌落后在菌落边缘挑取菌丝并转移至新的PDA平板培养基上培养出菌株。
7.根据权利要求1所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：所述步骤三中，对菌株进行单孢纯化处理的具体步骤为：先在载玻片上滴加一滴无菌水，接着将步骤二中培养的菌株的分生孢子挑取至载玻片上的无菌水中，使分生孢子在无菌水中均匀分散，得到孢子悬浮液并均匀涂布接种在新的PDA平板培养基上进行恒温培养，直至萌发出单菌落。
8.根据权利要求1所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：所述步骤四中，单孢纯化菌株转移至PDA平板培养基上在25℃的黑暗环境下培养60h，菌落的形态特征和菌丝的形态特征包括颜色、光泽度和形状。
9.根据权利要求1所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：所述步骤五中，对测序结果进行分析的具体步骤为：先利用真菌DNA提取试剂盒提取步骤四中菌丝的DNA，并采用真菌核糖体基因内转录间隔区通用引物ITS1和ITS4对提取的DNA进行PCR扩增，以扩增目的片段并对扩增产物进行测序，再将测序结果与Genbank中已知种属的序列进行序列比对和同源性分析。
...【技术特征摘要】
1.一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：所述步骤一中，所述培养基的具体配置步骤为：先称取200g去皮后的马铃薯切块放入1000ml的去离子水中蒸煮30min，再将去离子水中的马铃薯切块滤除并得到滤液，接着称取20g琼脂加入滤液中加热融化，随后称取20g葡萄糖加入滤液中继续加热，待葡萄糖完全溶解后滤除滤液中的杂质，然后补充去离子水定容至1000ml制得培养基混合液，之后将培养基混合液分装到三角瓶中进行高压灭菌，灭菌完毕后平均倒入各培养皿中水平静置，待凝固后制得pda平板培养基。
3.根据权利要求2所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：葡萄糖完全溶解于滤液后调节ph值至5.5～6.5，培养基混合液在三角瓶中分装后完毕后放入高压灭菌锅中以121℃的温度灭菌30min，培养皿在倒入培养基混合液前先进行消毒灭菌处理。
4.根据权利要求1所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：所述步骤二中，分离病斑组织的具体步骤为：先采用经高温消毒的刀片从采集的嫩枝和嫩叶上切取病健交界处5×5mm大小的病斑组织，接着先后用酒精和升汞溶液对切取的病斑组织进行浸泡。
5.根据权利要求4所述的一种伞房属树种新芽枯萎病的病原菌分离鉴定方法，其特征在于：对病斑组织浸泡的具体步骤为：先配置浓度为75%的酒精对病斑组织浸泡15s，酒精浸泡完毕后利用无菌水对病斑组织进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈升侃，甘春雁，李昌荣，唐庆兰，陈健波，郭东强，邓紫宇，刘媛，卢翠香，任世奇，伍琪，朱慧，韦振道，向旺，
申请(专利权)人：广西壮族自治区林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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