【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗菌肽提取及检测，尤其涉及一种饲料中抗菌肽nz2114的提取和净化方法及检测方法。
技术介绍
1、抗菌肽nz2114是首例真菌防御素plectasin经氨基酸改造后获得的衍生肽，对革兰氏阳性菌具有抗菌特异性，且抗菌活性优于母肽。此外，抗菌肽nz2114具有胞内杀菌活性、无溶血性和细胞毒性、药物半衰期长等优势，有望成为新型抗菌药物。而毒理学安全评价是新药研发的基础，通过向小鼠饲喂含低中高浓度抗菌肽nz2114的维持饲料，并分析其对小鼠造成的毒性反应、严重程度、发生频率和毒性作用机制，以确保药物临床用药安全。然而，饲料中抗菌肽nz2114能否均匀分布一定程度上影响毒理学试验结果，故需开发一种定量方法以检测饲料中抗菌肽nz2114的含量，并评估其均一性。
2、目前检测抗菌肽的方法主要有生物检定法、色谱法、免疫学方法和活体成像技术等。生物检定法是一种以功能性的特异生物应答为基础，测定待测物质生物活性的检测方法，主要用于生物制品纯度、稳定性和效价的测定。但此方法易受活性代谢物、生物基质、环境因素的影响，且检测限较高，无法满足本试验的需求。色谱技术中色谱-质谱串联技术(lc-ms)由于其具有分辨率高、适用性广和检测限低等优点，被广泛应用于医学、化学、环境和农学等领域，然而，由于该技术中包含了电喷雾离子化系统的质谱分析，容易对不同基质中待测物尤其是多肽类物质的定量检测产生基质干扰。
3、高效液相色谱(hplc)技术因其准确度和精密度高、稳定性好、对样品的适用性广，不受分析对象理化性质的影响，几乎所有的物质
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种饲料中抗菌肽nz2114的提取、净化及检测方法，通过提取和净化能够得到回收率高的抗菌肽nz2114溶液，且重复性好，随后对该方法进行验证，以获得能够精准定量饲料中抗菌nz2114含量的高效液相色谱检检测方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供一种饲料中抗菌肽nz2114的提取方法，包括：
3、将饲料样品加入到na2edta-mcllvaine缓冲溶液和乙腈组成的混合溶液中，超声后离心，取上清液即得到抗菌肽nz2114提取液；
4、所述饲料样品包括全价料和抗菌肽nz2114，所述全价料主要包括玉米粉、麦麸、豆粕和鱼粉。
5、根据饲料样品组成可以看出，其成分复杂，且豆粕和鱼粉中均含量大量蛋白质，因此需要对提取方法进行改进，以从饲料中提取出抗菌肽nz2114，本专利技术研究表明通过na2edta-mcllvaine缓冲溶液和乙腈能够将饲料中的大部分抗菌肽nz2114浸出。
6、进一步的，所述全价料主要包括玉米粉55-65％、麦麸8-12％、豆粕16-22％和鱼粉3-7％。
7、进一步的，所述全价料按质量百分比包括：玉米粉55-65％、麦麸8-12％、豆粕16-22％、鱼粉3-7％、酵母0.5-1.5％、骨粉1-3％、蛋氨酸0.1-0.2％、氯化钠0.5-1.5％和植物油1-2％。
8、进一步的，所述全价料按质量百分比包括：玉米粉58-62％、麦麸9-11％、豆粕18-20％、鱼粉4-6％、酵母0.8-1.2％、骨粉1.5-2.5％、蛋氨酸0.15-0.2％、氯化钠0.8-1.2％和植物油1.2-1.6％。
9、在一些具体实施方式中，所述全价料按质量百分比包括：玉米粉60.54±0.5％、麦麸10±0.5％、豆粕19±0.5％、鱼粉5±0.5％、酵母1±0.1％、骨粉1.9±0.1％、蛋氨酸0.16±0.01％、氯化钠1±0.1％和植物油1.4±0.1％。
10、进一步的，所述抗菌肽nz2114的添加量为2000～50000mg/kg饲料样品。抗菌肽nz2114在饲料中能够均匀分布，因此随机采样测得的结果准确性有保证。
11、进一步的，所述饲料样品的制备方法包括：全价料经大型粉碎机粉碎后过60目筛，向其中加入抗菌肽nz2114粉状原料药，经饲料混匀机将药物均匀分布在粉碎的全价料中，得到饲料样品。
12、进一步的，步骤s1中，所述na2edta-mcllvaine缓冲溶液和乙腈的体积比为85:15～100:0，优选为92:8～95:5，更优选为95:5。实验结果表明na2edta-mcllvaine缓冲溶液和乙腈的体积比为95:5时，提取率最高，且平行性好，能够保证提取稳定性，进而保证检测结果的准确性。
13、进一步的，所述na2edta-mcllvaine缓冲溶液由磷酸氢二钠、柠檬酸和乙二胺四乙酸二钠溶于超纯水中得到，ph值为4.00±0.05。通过氢氧化钠或盐酸调节ph值。
14、所述na2edta-mcllvaine缓冲溶液中磷酸氢二钠的浓度为0.07±0.01mol/l，柠檬酸的浓度为0.06±0.01mol/l，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.1±0.01mol/l。
15、进一步的，所述超声的时间为10-30min，优选为20min。实验结果表明，超声提取时间对提取率的影响较小，其中超声20min时，提取率相对最高，且多次实验的提取率稳定性好。
16、进一步的，将离心得到的沉淀物再次加入到na2edta-mcllvaine缓冲溶液和乙腈组成的混合溶液中进行超声提取，并将两次离心得到的上清液合并，从而提高样品中抗菌肽nz2114的提取率。
17、本专利技术还提供一种饲料中抗菌肽nz2114的净化方法，包括如下步骤：
18、s1、依次采用甲醇、超纯水和氨化甲醇对wcx净化柱进行活化、平衡和ph值调节；
19、s2、将以上任一项所述的提取方法得到的抗菌肽nz2114提取液加入到步骤s1处理后的wcx净化柱中，经甲醇与超纯水的混合溶剂除杂后，采用甲酸和甲醇组成的混合溶剂将抗菌肽nz2114从wcx净化柱上洗脱，得到抗菌肽nz2114洗脱液。
20、通过wcx净化柱净化后，杂质含量少，且回收率高，能够减少杂质对hplc检测的干扰。
21、进一步的，步骤s1中，所述氨化甲醇中氨水的体积为甲醇的1～3％。实验结果表明，上样前加入氨化甲醇能够对wcx净化柱的ph值进行调控，进而防止抗菌肽nz2114随清洗剂流下而造成大量损失。
22、进一步的，步骤s3中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种饲料中抗菌肽NZ2114的提取方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的饲料中抗菌肽NZ2114的提取方法，其特征在于，所述超声的时间为10-30min，优选为20min；
3.根据权利要求1所述的饲料中抗菌肽NZ2114的提取方法，其特征在于，所述Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液和乙腈的体积比为85:15～100:0，优选为92:8～95:5；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的饲料中抗菌肽NZ2114的提取方法，其特征在于，所述全价料按质量百分比包括：玉米粉55-65％、麦麸8-12％、豆粕16-22％、鱼粉3-7％、酵母0.5-1.5％、骨粉1-3％、蛋氨酸0.1-0.2％、氯化钠0.5-1.5％和植物油1-2％；所述抗菌肽NZ2114的含量为2000～50000mg/kg饲料样品。
5.一种饲料中抗菌肽NZ2114的净化方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的饲料中抗菌肽NZ2114的净化方法，其特征在于，步骤S1中，所述氨化甲醇中氨水的体积为甲醇的1～3％。
...【技术特征摘要】
1.一种饲料中抗菌肽nz2114的提取方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的饲料中抗菌肽nz2114的提取方法，其特征在于，所述超声的时间为10-30min，优选为20min；
3.根据权利要求1所述的饲料中抗菌肽nz2114的提取方法，其特征在于，所述na2edta-mcllvaine缓冲溶液和乙腈的体积比为85:15～100:0，优选为92:8～95:5；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的饲料中抗菌肽nz2114的提取方法，其特征在于，所述全价料按质量百分比包括：玉米粉55-65％、麦麸8-12％、豆粕16-22％、鱼粉3-7％、酵母0.5-1.5％、骨粉1-3％、蛋氨酸0.1-0.2％、氯化钠0.5-1.5％和植物油1-2％；所述抗菌肽nz2114的含量为2000～50000mg/kg饲料样品。
5.一种饲料中抗菌肽nz...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，冯亚楠，滕达，毛若雨，杨娜，郝娅，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：
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