【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫细胞，涉及一种筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法。
技术介绍
1、近年来，随着肿瘤微环境研究的不断深入。免疫治疗，特别是免疫检查点抑制剂已被应用于多种恶性肿瘤，而子宫内膜癌中的免疫治疗研究起步较晚，且大多数临床研究将目光集中于微卫星不稳定型内膜癌。
2、作为分子分型中另一类肿瘤突变负荷高、免疫原性好的肿瘤亚型，pole突变型内膜癌患者却未能在免疫检查点阻滞剂单药临床试验中表现出明显的获益。pole基因编码人类dna聚合酶最大的催化亚基，其突变可造成基因组突变数量异常累积，因此可产生大量新生抗原。测序技术的发展可识别出候选肿瘤新抗原的多肽，因此合成个性化多肽，建立特异性t细胞应用于肿瘤的精准免疫治疗方式成为可能。pole突变型内膜癌可产生大量新生抗原，提示可能对此种免疫治疗有较好的疗效。
3、tcr测序提示，这些pole突变抗原特异性t细胞均呈现寡克隆tcr重排特性，可能是针对pole突变抗原进行特异性识别的，因此如何筛选具有pole抗原特异性t细胞显得尤为重要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法，对pole突变抗原进行特异性识别。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法，所述的方法包括：
3、合成pole突变抗原肽mhc复合物四聚体：将pole突变型抗原肽与hla-1、b2m复合物形成pole突变抗原肽mhc复合物四聚体；p>
4、tcr mrna脂质体融合转染t细胞获得pole突变抗原特异性t细胞；
5、使用pole突变抗原肽mhc复合物四聚体分选pole突变抗原特异性t细胞。
6、优选地，使用生物素化修饰结合荧光修饰的去亲和素，修饰pole突变抗原肽mhc复合物四聚体。
7、优选地，通过流式细胞仪筛选出pole抗原特异性t细胞。
8、优选地，所述的合成pole突变抗原肽mhc复合物四聚体包括：
9、步骤s1：合成ploe的突变表位多肽，多肽纯度不低于90％；
10、步骤s2：大肠杆菌表达的重组蛋白hla-a*02:01和β2microglobulin(β2m)的重组表达，加入步骤s1中合成的ploe的突变表位多肽进行折叠，形成mhc class i/多肽复合物单体；
11、步骤s3：经超滤浓缩后，通过分子排阻色谱法获得折叠后复合物单聚体，层析后与a280吸收峰所在溶液管中液体合并；
12、步骤s4：将复合单体中mhc-i重链的c端上的赖氨酸残基生物素化，将生物素化复合单聚体纯化获得单一吸收峰纯品，生物素化分子排阻色谱后与a280吸收峰所在溶液管中的溶液合并；
13、步骤s5：纯化后的生物素化单体与标记了荧光色素的链霉亲和素结合，形成四聚体。
14、优选地，所述的tcr mrna脂质体融合转染t细胞获得pole突变抗原特异性t细胞包括：
15、步骤s6：取含有ploe的突变表位多肽的hla-a1101突变阳性患者的外周血，制备pbmc；
16、步骤s7：使用淋巴细胞分离液与步骤s6制备的pbmc混合，然后在无菌条件转移到离心管中；
17、步骤s8：在步骤s7所获得的含有pbmc和淋巴细胞分离液的离心管中加入edta抗凝全血，在血液和淋巴细胞分离液(lsm)中形成一个明显的分层；
18、步骤s9：离心后沉淀红细胞和多形核白细胞，同时在lsm上形成一层单核淋巴细胞，吸出淋巴细胞层上方2-3mm的血浆，吸取淋巴细胞层以及它下面一半的lsm层，并转移到另外一个离心管；加入等体积的平衡盐缓冲液至离心管内的淋巴细胞层中，离心；
19、步骤s10：清洗细胞，使用培养基重悬t细胞后接种于细胞培养容器，培养过夜后将悬浮细胞分离至单独培养皿继续培养；向贴壁细胞中加入il4、ploe的突变表位多肽、gm-csf后继续培养，后续每隔1日加入ploe的突变表位多肽，添加3-10次；
20、步骤s11：3天后，加入步骤10中重悬培养的t细胞，培养至少20天，收集所有细胞，离心后重悬为浓度为(0.5-3)x106个细胞/ml，在细胞悬液中加入四聚体，避光孵育。
21、优选地，所述的使用pole突变抗原肽mhc复合物四聚体分选pole突变抗原特异性t细胞包括：在待分选细胞样品中加入cd8抗体，孵育、离心、去掉上清液；然后将细胞重悬，通过流式分析平台检测待分选细胞样品，出现pole四聚体和cd8+双阳细胞后，使用bdfacsmelodytm流式细胞分选仪分选双阳细胞(参见图6)。
22、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的mhc被称为hla(human leukocyteantigen，hla)，即人白细胞抗原；小鼠mhc则被称为h-2。hla位于人的6号染色体短臂上，h-2位于小鼠的17号染色体上。
23、mhc可以分为经典mhc与非经典mhc两类，经典mhc包括mhc i、mhc ii、mhc iii基因，分别编码mhc i分子、mhc ii分子、mhc iii分子。其中，mhc class i(mhc i)：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链(peptide)透过mhc提示在细胞外侧，可以供杀手cd8+t细胞等辨识，以进行扑杀。
24、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
25、lsm(lymphocyte separation medium)是人淋巴细胞分离液,可以从人外周血、脐带血、小鼠全血等分离单个核细胞(淋巴细胞)。
26、t细胞抗原受体(tcr)是可以赋予个体几乎是无限的抗原识别和应答能力的胚系基因，能够保证个体在多变环境中能和外来抗原(病原体)发生有效的免疫应答。
27、本专利技术还提供了一种具有pole抗原特异性t细胞，所述的具有pole抗原特异性t细胞通过上述方法制备获得。
28、优选地，所述的pole突变型抗原肽的序列选自以下中的一个或者多个：
29、ylpvgshnl(seq id no 1)；
30、sylpvshnl(seq id no 2)；或者，
31、lafdiettk(seq id no 3)。
32、本专利技术提供了具有pole抗原特异性t细胞在制备杀伤表达pole抗原细胞的药物中的应用。
33、优选地，所述的杀伤表达pole抗原细胞的药物对表达pole抗原的细胞具有杀伤作用。
34、优选地，具有pole抗原特异性t细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：
2.根据权利要求1所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，使用生物素化修饰结合荧光修饰的去亲和素，修饰POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体。
3.根据权利要求1所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，通过流式细胞仪筛选出POLE抗原特异性T细胞。
4.根据权利要求1所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述的合成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体包括：
5.根据权利要求1所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述的TCR mRNA脂质体融合转染T细胞获得POLE突变抗原特异性T细胞包括：
6.根据权利要求1所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述的使用POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体分选POLE突变抗原特异性T细胞包括：在待分选细胞样品中加入CD8抗体，孵育、离心、去掉上清液；然后将细胞重悬，通过流式分析平台检测待分选细胞样品，出现POLE四
7.一种具有POLE抗原特异性T细胞，其特征在于，所述的具有POLE抗原特异性T细胞通过权利要求1-6中任意一种方法制备获得。
8.根据权利要求7所述的具有POLE抗原特异性T细胞，其特征在于，所述的POLE突变型抗原肽的序列选自以下中的一个或者多个：
9.权利要求7所述的具有POLE抗原特异性T细胞的应用，其特征在于，表达PLOE突变表位多肽的T细胞在制备杀伤表达POLE抗原细胞的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的杀伤表达POLE抗原细胞的药物对表达POLE抗原的细胞具有杀伤作用；或者，PD-L1与所述的杀伤表达POLE抗原细胞的药物联用，作为抑制表达POLE抗原的细胞的药物组合物。
...【技术特征摘要】
1.一种筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：
2.根据权利要求1所述的筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法，其特征在于，使用生物素化修饰结合荧光修饰的去亲和素，修饰pole突变抗原肽mhc复合物四聚体。
3.根据权利要求1所述的筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法，其特征在于，通过流式细胞仪筛选出pole抗原特异性t细胞。
4.根据权利要求1所述的筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法，其特征在于，所述的合成pole突变抗原肽mhc复合物四聚体包括：
5.根据权利要求1所述的筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法，其特征在于，所述的tcr mrna脂质体融合转染t细胞获得pole突变抗原特异性t细胞包括：
6.根据权利要求1所述的筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法，其特征在于，所述的使用pole突变抗原肽mhc复合物四聚体分选pole突变抗原特异性t细胞包括：在待分选...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。