【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及非洲猪瘟病毒检测，具体为一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物、探针及检测方法。
技术介绍
1、非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。目前尚无安全有效的疫苗用于预防asf，也无有效药物进行治疗，一旦确定是asf，扑杀是唯一的处理方法，以免造成更多猪群感染。因此，要实现对asf疫情的控制，只能从监测和早期诊断出发。由于asf的发病症状与其他多种猪病的症状相似，所以临床上鉴别诊断有很大困难，还需要依靠实验室诊断确诊，并且asfv潜伏期较长，抗体只有在病毒感染一定时期后才会出现，因此抗原检测目前是早期筛查的有效手段。目前，鉴定asfv抗原的方法主要有pcr、荧光定量pcr、玫瑰花环法(had)和直接免疫荧光技术(dif)。常规pcr方法灵敏度和特异性都较低；玫瑰花环法容易出现假阴性，有些不吸附红细胞的asfv毒株会被误判为阴性；直接免疫荧光技术(dif)有较高敏感性和特异性，但要求较高技术和荧光显微镜，且耗时长。而荧光定量pcr技术具有高灵敏性、高特异性，操作简便，安全无污染，重复性好等优点，因此，利用荧光定量技术对asfv进行早期诊断和快速筛查，对防控asf十分必要。
2、目前已有很多学者在进行关于非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr检测方法的研究，并构建出多种病毒基因的检测方法。2003年，king等首次使用taqman探针构建出检测非洲猪瘟的实时pcr检测方法，并在2012年被引入oie手册，该方法以vp72作为靶点，检测限为10-100拷贝/μl。2020年，王彩霞等根据asf
3、但是现有技术中还存在以下不足：一是目前针对非洲猪瘟病毒的分子检测主要是靶向p72，鉴于国内毒株出现各种类型的变异，毒株类型复杂化的趋势，仅检测p72不能对具体的非洲猪瘟病毒毒株类型和基因缺失毒株进行区分，已经无法满足当前的疫情防控需求。二是目前荧光pcr检测技术存在敏感性不够、特异性不强的问题。为此提出一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量引物、探针及检测方法来解决上述问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物、探针及检测方法，解决了现有技术在对毒株检测不能满足当前的疫情防控需求的问题。
2、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物，包括asfv p72基因特异性引物、asfv cd2v基因特异性引物以及asfv mgf 360-12l基因特异性引物。
3、优选的，所述asfv p72基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物p72-l和反向引物p72-r。
4、优选的，所述asfv cd2v基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物cd2v-l和反向引物cd2v-r。
5、优选的，所述asfv mgf 360—12l基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物mgf360-12l-l和反向引物mgf 360-12l-r。
6、一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr的探针，包括asfv p72基因特异性探针、asfv cd2v基因特异性探针和asfv mgf 360-12l基因特异性探针。
7、优选的，所述asfv p72基因特异性探针包括核苷酸序列的p72-p。
8、优选的，所述asfv cd2v基因特异性探针包括核苷酸序列的cd2v-p。
9、优选的，所述asfv mgf 360-12l基因特异性探针包括核苷酸序列的mgf 360-12l-p。
10、优选的，所述探针的5‘端修饰有报告基团，分别为fam、vi c、cy5；3’端修饰有淬灭基团，分别为bhq1、bhq2。
11、一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr检测方法，包括将样本与引物和探针组反应，然后通过荧光定量技术检测反应产物的荧光信号以确定非洲猪瘟病毒的存在。
12、本专利技术提供了一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物、探针及检测方法。具备以下有益效果：
13、1、本专利技术可以在一个反应里能同时检测非洲猪瘟病毒p72、cd2v、mgf360-12l基因，不仅能够获知是否存在非洲猪瘟的感染，而且能够明确感染毒株的是否存在这些基因的缺失，省时高效。
14、2、本专利技术针对三个靶标的扩增相互不干扰，且特异性强、灵敏度高、重复性好，且三个靶标的扩增均可以低至单个拷贝，充分保证了对每个靶标的扩增，保证了每个靶标的高灵敏度。
15、3、本专利技术综合各种因素分别设计了针对这三个靶标的多套引物探针组合，并且根据反应的特异性、扩增的效率进行筛选与优化，最终选择出本专利技术的引物和探针组合，达到上述极其优异的效果。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR引物，其特征在于，包括ASFV P72基因特异性引物、ASFV CD2v基因特异性引物以及ASFV MGF 360-12L基因特异性引物。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR引物，其特征在于，所述ASFV P72基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物P72-L、反向引物P72-R。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR引物，其特征在于，所述ASFV CD2v基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物CD2v-L、反向引物CD2v-R。
4.根据权利要求1所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR引物，其特征在于，所述ASFV MGF 360-12L基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物MGF 360-12L-L、反向引物MGF 360-12L-R。
5.一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR的探针，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR引物，包括ASFV P72基因特异性探针、ASFV
6.根据权利要求5所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR的探针，其特征在于，所述ASFV P72基因特异性探针包括核苷酸序列的P72-P。
7.根据权利要求5所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR的探针，其特征在于，所述ASFV CD2v基因特异性探针包括核苷酸序列的CD2v-P。
8.根据权利要求5所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR的探针，其特征在于，所述ASFV MGF 360-12L基因特异性探针包括核苷酸序列的MGF 360-12L-P。
9.根据权利要求5所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR的探针，其特征在于，所述探针的5‘端修饰有报告基团，分别为FAM、VIC、CY5；3’端修饰有淬灭基团，分别为BHQ1、BHQ2。
10.一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，使用权利5-9任一项所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR的探针，以及权利1-4任一项所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量PCR引物，包括将样本与引物和探针组反应，然后通过荧光定量技术检测反应产物的荧光信号以确定非洲猪瘟病毒的存在，以及鉴定是否存在以上基因缺失，可有效区分非洲猪瘟野毒株与非洲猪瘟CD2v/MGF360-12L基因缺失毒株。
...【技术特征摘要】
1.一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物，其特征在于，包括asfv p72基因特异性引物、asfv cd2v基因特异性引物以及asfv mgf 360-12l基因特异性引物。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物，其特征在于，所述asfv p72基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物p72-l、反向引物p72-r。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物，其特征在于，所述asfv cd2v基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物cd2v-l、反向引物cd2v-r。
4.根据权利要求1所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物，其特征在于，所述asfv mgf 360-12l基因特异性引物包括核苷酸序列的正向引物mgf 360-12l-l、反向引物mgf 360-12l-r。
5.一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr的探针，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物，包括asfv p72基因特异性探针、asfv cd2v基因特异性探针和asfv mgf 360-12l基因特异性探针。
6.根据权利要求5所述的一种鉴别...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾红，朱鸿飞，翟文竹，袁维峰，黄颖，庞忠宝，王振，何宇恒，储媛媛，陶春豪，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。