【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病原菌检测方法，尤其涉及一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、苹果黑星病(apple scab)是由苹果黑星病菌(venturia inaequalis)引起的一种真菌病害，可危害苹果的叶片、叶柄、枝条、芽鳞、花器和果实，造成严重的经济损失。除苹果外，该病还可以侵染苹果属中山楂(crataegus spp.)、花楸(sorbus spp.)、枇杷(eriobotrya japonica)、火棘(pyracantha spp.)、花红(malus asiatica nakai)、小苹果(malus spp.)等。
2、苹果黑星病菌属于中高等级风险的病原菌，在我国具有较高的扩散风险。因此，研发苹果黑星病菌的快速检测鉴定技术体系对我国苹果产业发展意义重大。为此我们提出一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法，旨在解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种检测苹果黑星病菌的rpa引物及crispr/cas12a引物。
4、进一步的，所述rpa的上游引物rpa-f如seq id no.1所示，rpa的下游引物rpa-r如seq id no.2所示，crispr/cas12a的指导rna引物如seq id no.3所示。
5、一种检测苹果黑星病菌的
6、进一步的，还包括cas12蛋白、t7转录酶、dna聚合酶以及cas12/13专用核酸检测试纸条。
7、一种检测苹果黑星病菌的方法，包括以下步骤：
8、步骤s1、利用rpa扩增产物、体外转录合成的指导rna和fb探针建立crispr/cas12a检测反应体系；
9、60μl的crispr/cas12a检测反应体系包括以下成分：
10、10×neb cutsmart buffer:6μl；
11、cas12a(1μm):6μl；
12、指导rna(300nm):18μl；
13、fb探针(1μm):2μl；
14、rpa反应产物:2μl；
15、无酶水:26μl；
16、步骤s2、反应结束后将cas12/13专用核酸检测试纸条插入到反应管中，观察试纸条上检测线的变化；若在试纸条的测试条带上出现颜色变化，即为阳性反应，证明含有苹果黑星病菌。
17、进一步的，所述步骤s1中，crispr/cas12a检测反应体系的反应条件为：在37℃下反应20-30min。
18、进一步的，所述步骤s2中，试纸条插入到反应管中的检测时间为2-3min。
19、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
20、1、特异性强。本专利技术通过在antismash上预测了苹果黑星病菌次级代谢产物基因，选择sm6.1-nrps基因作为检测靶标，从其相对保守区域获得苹果黑星病菌的特异性区间以及特异性靶标位置，可实现苹果黑星病菌的精准、快速鉴定。
21、2、灵敏度高。本专利技术对苹果黑星病菌的检测灵敏度极高，每个反应可检测低至0.001fg/ul。
22、3、结果准确。本专利技术通过rpa引物扩增、cas12a-指导rna的靶定裂解双层保障，确保检测结果的准确性和可靠性。
23、4、实用性高。本专利技术通过一次合成体外指导rna，即可长期使用，且整个检测技术方法只需要在恒温(37℃)条件下进行短时间反应，不需要成本较高的仪器设备，结果可直接通过试纸条反应来判断，整个检测流程小于1h，能够快速准确地检测出病原菌，可用于苹果黑星病菌的早期田间鉴定。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种检测苹果黑星病菌的RPA引物及CRISPR/Cas12a引物。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述RPA的上游引物RPA-F如SEQ ID No.1所示，RPA的下游引物RPA-R如SEQ ID No.2所示，CRISPR/Cas12a的指导RNA引物如SEQ IDNo.3所示。
3.一种检测苹果黑星病菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Cas12蛋白、T7转录酶、DNA聚合酶以及Cas12/13专用核酸检测试纸条。
5.一种检测苹果黑星病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，CRISPR/Cas12a检测反应体系的反应条件为：在37℃下反应20-30min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，试纸条插入到反应管中的检测时间为2-3min。
【技术特征摘要】
1.一种检测苹果黑星病菌的rpa引物及crispr/cas12a引物。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述rpa的上游引物rpa-f如seq id no.1所示，rpa的下游引物rpa-r如seq id no.2所示，crispr/cas12a的指导rna引物如seq idno.3所示。
3.一种检测苹果黑星病菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡小平，黄颖琪，王强，秦君，黄卫利，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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