【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体而言，涉及一种基于切刻酶辅助扩增技术与crispr结合的一体化核酸检测方法。
技术介绍
1、聚合酶链式反应(pcr)通过从一个特定dna片段的单个副本中产生数百万个dna序列副本，是实验室核酸检测的金标准。其主要原理是在热稳定dna聚合酶的作用下，利用温度循环实现引物识别和延伸，完成特定dna片段的体外扩增。仅需少量dna，在经过循环指数扩增后就可达到可检测水平，这为分析人员的定量和定性分析提供了便利条件。但精确控制温度循环需要精密的设备，这导致该方法只能集中在实验室中进行。
2、近年来兴起的等温扩增技术填补了pcr技术的局限性，环介导等温扩增技术(lamp)是利用嗜热脂肪芽孢杆菌(bst)dna聚合酶在60至65℃的等温条件下实现核酸大量复制的体外扩增反应，其可以在约30min实现目标核酸的检测。重组酶聚合酶扩增技术(rpa)是另外一种极具潜力的恒温扩增方法，rpa使用两个引物于37～42℃的恒定温度下在20～40分钟内实现目标序列的指数扩增。常温反应、简单的程序和短的扩增时间使得rpa成为核酸检测的有力技术。滚环扩增(rca)是一种作用于环状dna分子的等温扩增反应。rca利用具有链置换活性的phi 29噬菌体dna聚合酶来延伸与环状dna模板退火的单个或多个引物。聚合酶的链置换活性允许新合成的dna模板置换先前产生的dna分子从而释放ssdna，rca反应大多数是在37～40℃下约40分钟完成。
3、切刻酶辅助扩增技术(near)是通过dna聚合酶和切刻酶的协同作用实现的核酸
4、为推广near的应用，将near与其他分析方法结合使用，已经开发出具有各种信号输出工具的核酸传感器，如荧光、比色和电化学信号。near可以用cdte量子点作为荧光标记，分子信标可用作near反应的报告器，与其他放大方法结合开发超低检测限双扩增检测方法。此外，near反应也可用于传统可视化方法(如比色法)、经典的电化学dna传感器系统的核酸检测。但特异性效果仍然有限，因此需要开发更为精确地序列特异性分析方法。
5、近年来crispr/cas技术迅速发展，掀起了分子生物学领域的新变革，其高特异性、灵活、易于模块化分析的特点受到广泛关注，也逐渐被应用至扩增产物分析，成为新型的信号元件。crispr/cas体系主要通过cas效应蛋白与向导rna的相互作用调动体系的反应机制。所有cas效应蛋白都依赖crrna来引导对靶标双链dna、单链dna或单链rna底物的互补链的识别与结合，以实现顺式裂解活性。此外某些ii类cas蛋白如cas12a，cas12b，cas13a等具备反式切割活性，可以在cas效应蛋白顺式切割活性激活的同时，激活其反式切割活性，任意切割蛋白存在环境中的单链dna或单链rna，这一现象已被应用于核酸快速检测中。但其灵敏度有限，提高crispr/cas核酸分析灵敏度的一种手段是将靶标扩增，当与等温扩增技术结合时将大大提高扩增产物检测的序列特异性，有望提高检测的特异性和灵敏度，同时实现现场可视化分析。
6、然而，当将crispr/cas技术与等温扩增技术结合时，可能会出现一系列问题导致检测失败。第一，crispr/cas技术与等温扩增技术反应成分不兼容，同时调节体系中的多个反应组分更可能导致检测失败。第二，由于cas效应蛋白强烈的顺式与反式切割活性，会出现靶标和引物被cas效应蛋白过度消耗致使扩增失败，从而使检测失败。在此过程中，不得不开盖的两步式操作还带来了气溶胶污染问题。因此，针对目前的现有技术中存在的开盖污染、复杂的序列设计、繁琐的操作步骤、较长的反应时间、反应体系不兼容等问题，亟需开发一种更准确、简便、无污染的可视化扩增产物分析手段。
技术实现思路
1、crispr/cas体系的高度特异性靶标识别机制，为扩增条件苛刻的near体系提供了更优的产物分析途径。其中如何解决两个体系的不兼容性，near扩增效率与crispr/cas体系的切割效率差异是实现一体化的关键突破步骤，具有一定的挑战性。因此，本专利技术的目的是开发出一种基于切刻酶扩增与crispr/cas12b结合的一体化核酸检测方法，该方法反应效率高，并且可以在不打开反应容器的情况下进行检测过程和结果判定。
2、针对现有技术的不足，在第一方面，本专利技术提供了一种核酸检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
3、(1)针对待检测目标dna设计含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对，所述内引物对对应的上游内引物和下游内引物按5’至3’顺序包含三个部分：引物5’端为约11～13nt的随机序列区，紧接是切刻酶识别区gagtcnnnn，其后是约13～18nt的模板特异性识别区，所述模板特异性识别区选取在目标dna序列中cas12b识别位点两侧；所述外引物对的上游外引物是位于距所述上游内引物的上游3nt的16～20nt的序列，所述外引物对的下游外引物是位于距所述下游内引物的下游3nt的16～20nt的序列；
4、(2)提取待测样品的基因组dna；
5、(3)在所述基因组dna中一次性加入所述内引物对和外引物对、dntps、缓冲液、切刻酶、bst dna聚合酶、靶向目标dna的sgrna、cas12b蛋白、荧光标记的单链dna报告子，以进行扩增切割一体化反应；
6、(4)根据荧光标记的单链dna报告子类型对反应产物进行光照激发，从而判断所述目标dna是否存在。
7、在第二方面，本专利技术提供了一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：针对待检测目标dna设计的含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对、dntps、缓冲液、切刻酶、bstdna聚合酶、cas12b蛋白、靶向目标dna的sgrna、荧光标记的单链dna报告子；
8、其中所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在(3)中，反应温度为43～58℃，孵育5～30min；优选地，所述反应温度为45～58℃；更优选地，反应温度为57℃。
3.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：针对待检测目标DNA设计的含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对、dNTPs、缓冲液、切刻酶、Bst DNA聚合酶、Cas12b蛋白、靶向目标DNA的sgRNA、荧光标记的单链DNA报告子；
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCl、BSA、Na+、K+、Mg2+；优选地，所述缓冲液包括30～80mM Tris-HCl(PH＝7.9)，80～120mM NaCl，80～120μg/mLBSA，5～20mM Tris-HCl(PH＝8.8)，2～10mM(NH4)2SO4，70～100mM KCl，5～15mM MgCl2，0.05％～0.2％20；更优选地，所述缓冲液包括50mM Tris-HCl(PH＝7.9)，90mMNaCl，90μg/mL BSA，10
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述荧光标记的单链DNA报告子序列为：5’6-FAM-TTATTT-3’BHQ1，通过对反应产物进行蓝光照射来判断所述目标DNA是否存在。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述切刻酶选自Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nb.BtsI；优选地，所述切刻酶是Nt.BstNBI，所述切刻酶识别位点为GAGTCNNNN。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，在目标DNA序列中Cas12b识别位点的两侧选取13nt作为内引物的模板特异性识别区，在此特异性识别区外侧3nt处，选取16～20nt作为外引物；优选地，所述随机序列区为11～13nt，所述模板特异性识别区为13～17nt；更优选地，所述随机序列区为13nt，所述模板特异性识别区为13nt。
8.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶选自Bst 3.0DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶，大片段、Bst 2.0DNA聚合酶；优选地，所述Bst DNA聚合酶是Bst 3.0DNA聚合酶。
9.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述内引物对浓度为0.1～0.5μM，外引物对浓度为0.1～0.5μM，sgRNA浓度为0.5～1μM，单链DNA报告子浓度为0.5～1μM，Cas12b蛋白为0.1～0.2μM，切刻酶为8～10U、Bst DNA聚合酶为4～6U；优选地，内引物对浓度可以为0.1～0.3μM，外引物对浓度为0.2～0.4μM，sgRNA浓度为0.8～1μM，单链DNA报告子浓度为0.8～1μM；更优选地，内引物对浓度为0.1μM，外引物对浓度为0.2μM，sgRNA浓度为0.8μM，单链DNA报告子浓度为1μM，Cas12b蛋白为0.1μM，切刻酶为9U、Bst DNA聚合酶为5U。
10.权利要求1-9任一项所述的方法或试剂盒的用途，其特征在于，其用于核酸检测；优选地，用于检测Omicron质粒基因组DNA，其中所述内引物对的序列如SEQ.ID.NO1、SEQ.ID.NO2所示，所述外引物对序列如SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4所示，所述靶向目标序列的sgRNA序列如SEQ.ID.NO5所示。
...【技术特征摘要】
1.一种核酸检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在(3)中，反应温度为43～58℃，孵育5～30min；优选地，所述反应温度为45～58℃；更优选地，反应温度为57℃。
3.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：针对待检测目标dna设计的含有切刻酶识别位点的内引物对和外引物对、dntps、缓冲液、切刻酶、bst dna聚合酶、cas12b蛋白、靶向目标dna的sgrna、荧光标记的单链dna报告子；
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括tris-hcl、bsa、na+、k+、mg2+；优选地，所述缓冲液包括30～80mm tris-hcl(ph＝7.9)，80～120mm nacl，80～120μg/mlbsa，5～20mm tris-hcl(ph＝8.8)，2～10mm(nh4)2so4，70～100mm kcl，5～15mm mgcl2，0.05％～0.2％20；更优选地，所述缓冲液包括50mm tris-hcl(ph＝7.9)，90mmnacl，90μg/ml bsa，10mm tris-hcl(ph＝8.8)，5mm(nh4)2so4，90mm kcl，10mm mgcl2，0.05％20。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述荧光标记的单链dna报告子序列为：5’6-fam-ttattt-3’bhq1，通过对反应产物进行蓝光照射来判断所述目标dna是否存在。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法或试剂盒，其特征在于，所述切刻酶选自nt.bstnbi、nt.alwi、nt.bbvci、nb.btsi；优选地，所述切刻酶是nt.bstnbi，所述切刻酶识别位点为gagtcnnnn。
7.根...
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