【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种dna分子标记技术，具体设计基于美丽马醉木花与叶组织转录组开发的其ssr分子标记引物。
技术介绍
1、马醉木属(pieris d.don)植物在全世界约有7种，主要分布于亚洲东部、北关东部和西印度群岛。我国境内分布3种马醉木属植物，分别为马醉木(pieris japonica)、美丽马醉木(pieris formosa)和长萼马醉木(pieris swinhoei)，当中美丽马醉木为本属模式种、主要生长于长江以南海拔900-2300m的灌木丛中(wang et al.，1998)。马醉木属植物全株具有毒性，人畜误食可导致昏迷、呼吸困难与运动失调等症状，民间常将之用于治疗癣和疥疮(陈冀胜和郑硕.，1987)。美丽马醉木作为观赏植物在欧美和日本庭院种植历史悠久，其株型优美，花期为每年3月至5月、密生壶状小花，广泛用于切花、盆景及绿篱等，国内也选育了观赏新品种‘万紫红’(陈海云等，2019)。目前，关于美丽马醉木研究报道还极少，只有少量种子发芽、扦插育苗和资源遗传性分析等研究报道(陈海云等，2015、2018；李田等，2021)，在资源收集与遗传多样性评价研究方面还极其薄弱，不利于今后资源保护与开发利用、急需加强。
2、简单重复序列(simple sequence repeat，ssr)又称微卫星dna，特指由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段dna，广泛随机分布于真核生物核基因组中。在不同物种甚或不同个体中，微卫星中重复单位的数目存在高度变异、据此开发的ssr分子标记具有共显性遗传、多态性高
技术实现思路
1、本专利技术的目的旨在提供一种基于美丽马醉木花与叶组织转录组开发的其ssr分子标记引物，针对现有技术尚未利用马醉木dna序列开发马醉木微卫星标记的现状，基于花与叶组织转录组测序获得的81,010条unigene，利用msia软件鉴别ssr位点，开发出马醉木ssr分子标记，建立马醉木ssr的技术体系，并应用于马醉木优良高产无性系的遗传多样性研究及dna指纹图谱构建。
2、一方面，本专利技术提供基于美丽马醉木花与叶组织转录组开发的其ssr分子标记引物，所述引物包括c10094、c18966、c53597、c35666、c36541、c35817、c32272、c32089、c30210、c46914、c46248、c44512、c37798和c39598；14对引物的序列如seq id no.1-seq idno.28所示。
3、第二方面，本专利技术提供美丽马醉木ssr分子标记引物合成的分子标记，所述分子标记核苷酸序列如seq id no.101-seq id no.114所示。
4、第三方面，本专利技术提供一种美丽马醉木ssr分子标记引物的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
5、采集美丽马醉木的花与叶组织，并进行转录组测序；
6、将所述转录组测序得到的结果进行ssr位点的鉴别，统计ssr位点的分布特征和基元重复类型；
7、在所述统计得到的ssr位点同时进行引物设计，得到50对ssr位点分子标记引物；
8、提取美丽马醉木叶片样品的dna，并将所述dna与所述50对分子标记引物混合，通过pcr扩增和凝胶电泳验证分子标记引物的有效性和多态性。
9、可选地，统计ssr位点的分布特征和基元重复类型中步骤中，包括计算ssr位点的出现频率和ssr位点平均距离。
10、可选地，ssr的出现频率计算公式为ssr位点总数与unigene总条数的比值；ssr位点平均距离计算公式为unigene总长度除以ssr位点总数。
11、可选地，在所述统计得到的ssr位点同时进行引物设计步骤中，所述引物设计的参数为退火温度为55℃-65℃，gc碱基含量为40％-60％，引物长度18-27bp，pcr扩增产物大小为100-300bp。
12、可选地，通过pcr扩增和凝胶电泳验证分子标记引物的有效性和多态性，所述pcr扩增的体系包括pcr预混合溶液10μl、dna模板2μl、上下游引物各1μl，ddh2o补足至20μl。
13、可选地，通过pcr扩增和凝胶电泳验证分子标记引物的有效性和多态性，所述pcr扩增的程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃总延伸10min。
14、可选地，通过pcr扩增和凝胶电泳验证分子标记引物的有效性和多态性，所述凝胶电泳包括1％琼脂糖凝胶电泳和6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
15、可选地，所述1％琼脂糖凝胶电泳用于验证引物的有效性，即产物的单一性与大小与预计相似。
16、可选地，所述6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳用于通过条带位置差异验证引物多态性。
17、本专利技术具备的有益效果包括：
18、(1)本专利技术提供的美丽马醉木ssr分子标记引物的开发方法，首次利用马醉木的dna序列进行分子标记开发；
19、(2)本专利技术开发得到的马醉木ssr分子标记，具有良好的多态性，重复性高，是一种可靠、有效的分子标记；能够应用于马醉木优良高产无性系的遗传多样性研究及dna指纹图谱构建；同时为美丽马醉木种质资源的遗传评价、种质鉴定及分子标记辅助育种研究，为美丽马醉木种群遗传多样性研究和野生资源保护奠定基础。
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1.基于美丽马醉木花与叶组织转录组开发的其SSR分子标记引物，其特征在于，所述引物包括c10094、c18966、c53597、c35666、c36541、c35817、c32272、c32089、c30210、c46914、c46248、c44512、c37798和c39598；14对引物的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.28所示。
2.如权利要求1所述的引物合成的分子标记，其特征在于，所述分子标记核苷酸序列如SEQ ID NO.101-SEQ ID NO.114所示。
3.如权利要求1所述的引物的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，统计SSR位点的分布特征和基元重复类型中步骤中，包括计算SSR位点的出现频率和SSR位点平均距离。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述统计得到的SSR位点同时进行引物设计步骤中，所述引物设计的参数为退火温度为55℃-65℃，GC碱基含量为40％-60％，引物长度18-27bp，PCR扩增产物大小为100-300bp。
<...【技术特征摘要】
1.基于美丽马醉木花与叶组织转录组开发的其ssr分子标记引物，其特征在于，所述引物包括c10094、c18966、c53597、c35666、c36541、c35817、c32272、c32089、c30210、c46914、c46248、c44512、c37798和c39598；14对引物的序列如seq id no.1-seq id no.28所示。
2.如权利要求1所述的引物合成的分子标记，其特征在于，所述分子标记核苷酸序列如seq id no.101-seq id no.114所示。
3.如权利要求1所述的引物的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，统计ssr位点的分布特征和基元重复类型中步骤中，包括计算ssr位点的出现频率和ssr位点平均距离。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述统计得到的ssr位点同时进行引物设计步骤中，所述引物设计的参数为退火温度为55℃-65℃，gc碱基含量为40％-60％，引物长度18-27bp，pc...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪信东，张月婷，何素琳，符潮，温世钫，李田，楼浙辉，
申请(专利权)人：江西省林业科学院，
类型：发明
国别省市：
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