【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种csfv e0蛋白的纳米抗体csfv-e0-nb1及编码基因和应用。
技术介绍
1、猪瘟(classical swine fever，csf)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus，csfv)引起的猪的高度传染性和致命性传染病，对动物健康和养猪业有较大的影响；csf是世界动物卫生组织(world organization foranimal health，woah)规定的一种强制性报告疾病。csfv已在世界各地传播，造成了严重的养猪业损失，并对各国的经济造成了一定的影响。虽然一些国家通过使用疫苗等手段净化了csf，但包括中国在内，全球仍有多个国家和地区存在csf流行。一些以前宣布已经根除csf的国家或地区再次报道csf感染。csf的成熟诊断方法，如病毒分离、荧光抗体检测、抗原捕获抗体酶联免疫吸附测定、反转录聚合酶链反应、病毒中和试验和抗体elisa已被广泛使用。但是现在想要做到csfv e2亚单位疫苗株和野毒株的鉴别诊断，还需借助多个或多种检测方法，不便于猪场大规模监测以及现场应用。
2、典型的纳米抗体具有纳摩到皮摩范围的亲和力(平衡解离常数)，所以它们非常适合用于配体结合测定。低生产成本：小体积的纳米抗体使得在中等体积的细菌培养中更容易生产和高产量。易于编辑以满足应用需求(即，提高特异性和亲和力，扩大检测可能性)：编码纳米抗体的基因可以很容易地重新设计，以选择改变的结合特性或表位标记。坚固耐用，保质期长：与igs和scfv片段相比，纳米抗体具有较强的热
3、量子点具有一系列独特而优良的光学特性，包括：①量子点比有机荧光分子稳定，不易发生光漂白；②荧光吸收谱宽，单光子和双光子均可吸收；③发射谱窄(通常半峰宽低于40nm)而对称，无长波段拖尾现象；④荧光强度大，量子产率高(＞20％)，生物相容性好；⑤具有独特的量子效应和较大的斯托克斯位移；⑥与普通有机染料相比，量子点荧光命较长(20ns～40ns)，有利于提高检测结果的对比度和准确性。
4、综上所述，现在缺乏一种快速、便捷的鉴别csfv e2亚单位疫苗株和野毒株感染的检测方法。传统的胶体金等免疫层析技术检测灵敏度较低，传统的elisa检测方法需要实验室相关仪器和操作，rt-pcr等核酸检测方法无法评估疫苗免疫效果等。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种csfv e0蛋白的纳米抗体csfv-e0-nb1，基于纳米抗体和量子点免疫层析技术构建csfv e2亚单位疫苗株和野毒株抗体的免疫层析试纸条，可以及时、高效、快速的现场区分csfv e2亚单位疫苗株和野毒株感染，并且生产工艺简单，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。
2、本专利技术提供了一种csfv e0蛋白的纳米抗体csfv-e0-nb1，所述纳米抗体csfv-e0-nb1的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、本专利技术还提供了一种编码上述纳米抗体csfv-e0-nb1的核苷酸分子。
4、优选的，所述核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术还提供了一种表达上述纳米抗体csfv-e0-nb1的方法，包括将上述核苷酸分子与表达载体连接，构建重组表达载体，转化入表达宿主细胞中，诱导表达并纯化，得所述纳米抗体csfv-e0-nb1。
6、优选的，所述表达载体的类型包括原核表达载体。
7、本专利技术提供了一种csfv e2亚单位疫苗株和野毒株抗体的免疫层析试纸条，包括金标垫、检测线和质控线；
8、所述金标垫包被量子点耦联的csfv e0蛋白和量子点耦联的csfv e2蛋白；
9、以csfv e0蛋白和csfv e2蛋白分别为检测线t1和t2，以上述纳米抗体csfv-e0-nb1和csfv e2蛋白特异性纳米抗体分别为质控线c1和c2。
10、优选的，所述量子点耦联的方法包括：将水溶性量子点与edc·hcl溶液和nhs溶液避光孵育；孵育完成后，与β-巯基乙醇和蛋白混合孵育；孵育完成后封闭，将产物离心，沉淀复溶，得到量子点耦联的蛋白。
11、优选的，所述蛋白和量子点耦联的ph值为6～8；
12、量子点和活化剂的质量比为1:2～1:8；
13、所述蛋白和量子点的耦联质量比为1:1～1:15。
14、优选的，所述检测线上标记的蛋白量为50～150μg/线；
15、所述质控线上标记的纳米抗体的量为75～175μg/线。
16、优选的，当检测线t1标记csfv e0蛋白，检测线t2标记csfv e2蛋白；质控线c1标记csfv-e0-nb1蛋白，质控线c2标记csfv e2蛋白特异性纳米抗体时；
17、如检测线t1、检测线t2、质控线c1和质控线c2均无条带，说明检测不成功，需重新检测；
18、如质控线c1或质控线c2有一条或都没有条带，说明检测不成功，需要重新检测；
19、如检测线t1、质控线c1和质控线c2均有条带，检测线t2无条带，则说明检测不成功，需重新检测；
20、如检测线t1、检测线t2、质控线c1和质控线c2均有条带，则说明为野毒株产生的抗体；
21、如检测线t2、质控线c1和质控线c2均有条带，检测线t1无条带，则说明为csfv e2亚单位疫苗株产生的抗体；
22、如质控线c1和质控线c2均有条带，检测线t1和检测线t2均无条带，则说明为阴性，无csfv抗体。
23、有益效果：本专利技术通过csfv e0纳米抗体噬菌体展示文库技术筛选得到一种csfve0特异性纳米抗体csfv-e0-nb1，所述csfv-e0-nb1可以利用表达系统进行表达。本专利技术还将纳米抗体与量子点技术结合，制备了可以及时、高效、快速的现场区分csfv e2亚单位疫苗株和野毒株感染抗体的免疫层析试纸条，所述纳米抗体可降低获得质控抗体的成本，提高检测试纸条的稳定性，高稳定性更便于定量检测，无需elisa即可评估疫苗免疫效果，相比传统的单克隆抗体，获取途径更简单、体积更小、灵敏度及特异性更好；量子点的应用，直接提高了免疫层析试纸条的灵敏度以及特异性，相比传统的胶体金试纸条灵敏度更高，更有利于早检测到是否发生感染。本专利技术所述免疫层析试纸条生产工艺简单，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。
24、利用本专利技术所述免疫层析试纸条即可鉴别诊断csfv e2亚单位疫苗株和野毒株抗体，快速、便捷、即时的检测，为猪瘟净化工作的检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1，其特征在于，所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的核苷酸分子。
3.根据权利要求2所述核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
4.一种表达权利要求1所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的方法，其特征在于，包括将权利要求2或3所述核苷酸分子与表达载体连接，构建重组表达载体，转化入表达宿主细胞中，诱导表达并纯化，得所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述表达载体的类型包括原核表达载体。
6.一种CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株抗体的免疫层析试纸条，其特征在于，包括金标垫、检测线和质控线；
7.根据权利要求6所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述量子点耦联的方法包括：将水溶性量子点与EDC·HCl溶液和NHS溶液避光孵育；孵育完成后，与β-巯基乙醇和蛋白混合孵育；孵育完成后封闭，将
8.根据权利要求7所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述蛋白和量子点耦联的pH值为6～8；
9.根据权利要求6所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线上标记的蛋白量为50～150μg/线；
10.根据权利要求6所述免疫层析试纸条，其特征在于，当检测线T1标记CSFV E0蛋白，检测线T2标记CSFV E2蛋白；质控线C1标记CSFV-E0-Nb1蛋白，质控线C2标记CSFV E2蛋白特异性纳米抗体时；
...【技术特征摘要】
1.一种csfv e0蛋白的纳米抗体csfv-e0-nb1，其特征在于，所述纳米抗体csfv-e0-nb1的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体csfv-e0-nb1的核苷酸分子。
3.根据权利要求2所述核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的核苷酸序列如seqid no.2所示。
4.一种表达权利要求1所述纳米抗体csfv-e0-nb1的方法，其特征在于，包括将权利要求2或3所述核苷酸分子与表达载体连接，构建重组表达载体，转化入表达宿主细胞中，诱导表达并纯化，得所述纳米抗体csfv-e0-nb1。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述表达载体的类型包括原核表达载体。
6.一种csfv e2亚单位疫苗株和野毒株抗体的免疫层析...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文玲，张丽红，曹志，尹德华，李思雨，张艺馨，王晓铎，李硕，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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