【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生化分析与诊断技术领，具体涉及一种caspase-3的检测方法、胞内监测体系及其应用。
技术介绍
1、细胞凋亡是发生在多细胞生物中的程序性细胞死亡的一种形式。对细胞凋亡的不当控制最终可导致多种疾病，如癌症、神经退行性疾病、炎性疾病和病毒感染。对了解细胞凋亡相关疾病的机制的极大兴趣需要可靠和快速的成像技术。caspase-3是在细胞凋亡途径中发挥重要作用的半胱氨酸蛋白酶家族。caspase-3是细胞凋亡中的关键执行器，也是最有效的半胱天冬酶，活化的caspase-3可以切割凋亡细胞中的大部分细胞底物。因此，监测caspase-3的活性是细胞凋亡分析的重要方法。
2、迄今为止，已经开发了多种方法，包括高效液相色谱法(hplc)、质谱法(ms)和酶联免疫吸附测定(elisa)用于检测caspase-3活性。但上述传统方法存在着操作复杂、成本昂贵、动态监测差等问题，影响了实际中的使用。近年来，出现了几种新的方法，如荧光共振能量技术、表面等离子体共振技术和电化学法等。发现荧光技术具有简单、灵敏度高和特异性强等优点。目前已经开发了两大类荧光探针来监测caspase-3活性。第一组是指含有半胱天冬酶特异性肽亚单位的荧光探针。但是由于高荧光背景和差的细胞渗透性，这些荧光探针对细胞凋亡成像无效。第二组是双标记探针，其依赖于在两端具有供体/猝灭剂对或荧光共振能量转移对(fret)的caspase-3特异性肽底物的功能化。caspase-3的肽切割可导致供体/猝灭剂对的分离或fret的损失，这使得能够通过荧光强度和波长的变化
技术实现思路
1、鉴于目前存在的上述不足，本专利技术提供一种caspase-3的检测方法、胞内监测体系及其应用，本专利技术用于检测caspase-3活性，具有的检测方法操作简单，灵敏度高、特异性好的优点。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种caspase-3的检测方法，包括以下步骤：
3、步骤1：设计合成多肽探针ck-9，多肽探针ck-9的序列如seq id：1所示；合成还原氧化石墨烯rgo作为荧光团猝灭剂；其中，所述多肽探针ck-9作为caspase-3的底物，所述多肽探针ck-9的c端连接有荧光基团fam；
4、步骤2：将连接有荧光基团fam的多肽探针ck-9与还原氧化石墨烯rgo混合杂交形成复合探针；复合探针和hepes缓冲液混合制成检测溶液；
5、步骤3：将检测溶液和待测样品混合均匀，30-37℃反应1.5h-2h后测定荧光强度，根据荧光强度定性或定量caspase-3。
6、依照本专利技术的一个方面，所述rgo的合成过程为：将石墨烯go溶解在氢氧化钠溶液中，再在90℃下油浴搅拌进行还原，最后在经离心至上清液变为浅黄色，经探头超声处理得到沉淀，即为rgo。
7、依照本专利技术的一个方面，所述多肽探针ck-9、还原氧化石墨烯rgo在所述检测溶液中的浓度为100～500nm、2～10μg/ml。
8、依照本专利技术的一个方面，所述测定荧光强度的ex/em＝450/521，扫描范围500～560nm，狭缝宽度10nm。
9、基于同一专利技术构思，本专利技术还提供了一种caspase-3胞内成像监测体系，包括：
10、多肽探针ck-9，
11、多肽探针ck-9作为caspase-3的底物，多肽探针的c段连接荧光基团fam，多肽探针ck-9的序列如seq id：1所示；
12、还原氧化石墨烯rgo，
13、多肽探针ck-9通过π-π相互作用和氢键吸附在还原氧化石墨烯rgo的表面并引起荧光团的猝灭；
14、提前用不同浓度的顺铂或半胱天冬酶抑制剂处理的细胞。
15、基于同一专利技术构思，本专利技术还提供了上述的caspase-3胞内成像监测体系的制备方法，包括以下步骤：
16、步骤1：设计合成多肽探针ck-9，多肽探针ck-9的序列如seq id：1所示；合成还原氧化石墨烯rgo作为荧光团猝灭剂；其中，所述多肽探针ck-9的c端连接荧光基团fam；
17、步骤2：提前用不同浓度的顺铂或半胱天冬酶抑制剂处理细胞24h，将多肽探针ck-9和还原氧化石墨烯rgo混合均匀，室温下孵育25～35min后采用含1％胎牛血清的高糖培养基dmem稀释，得到所述caspase-3胞内成像监测体系
18、依照本专利技术的一个方面，所述多肽探针ck-9、还原氧化石墨烯rgo、顺铂、半胱天冬酶抑制剂在所述caspase-3胞内成像监测体系中的终浓度分别为500nm、3μg/ml、1～8μm和1μm。
19、基于同一专利技术构思，本专利技术还提供了上述caspase-3胞内成像监测体系的应用方法，用不同浓度的顺铂或半胱天冬酶抑制剂处理待测细胞24h，将多肽探针ck-9和还原氧化石墨烯rgo混合杂交形成复合探针加入到待测细胞中，36～38℃共孵育4～8h，再进行细胞核染色，在多维活细胞成像显微镜下观察拍摄。
20、依照本专利技术的一个方面，所述细胞核染色为采用hoechst 33342染色液染色20～30min。
21、本专利技术的有益效果：
22、本专利技术提供了一种caspase-3检测方法，通过设计一个还原氧化石墨烯(简称rgo)淬灭多肽探针，构建了一个新的生物传感系统。在该系统中，荧光团(fam)标记的多肽探针ck-9和rgo分别用作caspase-3的底物和荧光团猝灭剂。caspase-3在多肽探针底物上的水解可以产生两个不同长度的片段。荧光团标记的短片段的释放导致荧光信号的恢复，根据荧光强度定性或定量caspase-3。该检测方法操作简单，灵敏度高。
23、本专利技术所述caspase-3胞内成像监测体系，由于rgo的高相容性和运输能力，使得探针ck-9结合在rgo上高效进入胞内，可以在几小时内观察到胞内caspase-3的变化，且操作简单，方便快捷。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种非诊断目的caspase-3的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的caspase-3的检测方法，其特征在于，所述rGO的合成过程为：将石墨烯GO溶解在氢氧化钠溶液中，再在90℃下油浴搅拌进行还原，最后在经离心至上清液变为浅黄色，经探头超声处理得到沉淀，即为rGO。
3.根据权利要求1所述的caspase-3的检测方法，其特征在于，所述多肽探针CK-9、还原氧化石墨烯rGO在所述检测溶液中的浓度为100～500nM、2～10μg/mL。
4.根据权利要求1所述的caspase-3的检测方法，其特征在于，所述测定荧光强度的Ex/Em＝450/521，扫描范围500～560nm，狭缝宽度10nm。
5.一种caspase-3胞内成像监测体系，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的caspase-3胞内成像监测体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的caspase-3胞内成像监测体系的制备方法，其特征在于，所述多肽探针CK-9、还原氧化石墨烯rGO、
8.根据权利要求5所述的caspase-3胞内成像监测体系的应用方法，其特征在于，用不同浓度的顺铂或半胱天冬酶抑制剂处理待测细胞24h，将多肽探针CK-9和还原氧化石墨烯rGO混合杂交形成复合探针加入到待测细胞中，36～38℃共孵育4～8h，再进行细胞核染色，在多维活细胞成像显微镜下观察拍摄。
9.根据权利要求8所述的应用方法，其特征在于，所述细胞核染色为采用Hoechst33342染色液染色20～30min。
...【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的caspase-3的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的caspase-3的检测方法，其特征在于，所述rgo的合成过程为：将石墨烯go溶解在氢氧化钠溶液中，再在90℃下油浴搅拌进行还原，最后在经离心至上清液变为浅黄色，经探头超声处理得到沉淀，即为rgo。
3.根据权利要求1所述的caspase-3的检测方法，其特征在于，所述多肽探针ck-9、还原氧化石墨烯rgo在所述检测溶液中的浓度为100～500nm、2～10μg/ml。
4.根据权利要求1所述的caspase-3的检测方法，其特征在于，所述测定荧光强度的ex/em＝450/521，扫描范围500～560nm，狭缝宽度10nm。
5.一种caspase-3胞内成像监测体系，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏伟，寇振龙，刘晴，张大平，
申请(专利权)人：湖南艾科瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。