【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶提取，具体涉及一种溶菌酶的制备方法。
技术介绍
1、溶菌酶，又称胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，其化学名为n-乙酰胞壁质聚糖水解酶，溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其他体液(如淋液)中级白细胞和组织(如肝、肾)细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。溶菌酶能够水解细胞壁肽聚糖结构中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键，从而破坏细胞壁肽聚糖结构，导致微生物因细胞壁裂解而被杀死，且本身无毒无害，因而是一种天然的安全性能很好的杀菌剂，可以广泛应用于医疗、食品防腐及日用化工等行业。溶菌酶在人体内非特异性免疫中发挥着重要作用，具有杀菌抗炎，促进组织修复及增强免疫力等多种生物活性作用，是一种性质优良的药用酶，可用于主料急慢性鼻炎喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹及扁平庞等。它还可作为生物工程研究中的工具酶，用来提取微生物细胞内各类物质，以及进行原生质体制备及融合育种。此外，溶菌酶还具有抗病毒作用，可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，口服或局部应用溶菌酶对一些病毒性皮肤病具有明显的疗效。
2、随着人民生活水平的提高和健康意识的增强，食品添加剂及抗生素使用问题日益尖锐，食品、医药安全等问题引起了社会的广泛关注。寻找一种安全性高、抗菌效果好的替代物的研究备受关注。蛋清溶菌酶作为动物自身的一种非特异性免疫因子，无毒无害，对革兰氏阳性菌及少量革兰氏阴性菌有显著的溶菌作用。目前已被广泛的用于食品保鲜及医药
3、我国是产鸡蛋大国，但鸡蛋的深加工程度较低，而对溶菌酶的分离提取则可以提高蛋品的附加值。目前，溶菌酶的市场需求与日俱增，但溶菌酶的制备工艺并不完善，目前提取溶菌酶的方法主要有：直接结晶法、超滤法、离子交换树脂吸附法、亲和层析法等。其中直接结晶法制备溶菌酶，产品收率60％，并且结晶过程缓慢，ph对结晶效果影响较大，纯度和活性也低，不适合工业化生产；亲和层析法生产成本高，溶液黏度大时易造成树脂堵塞；离子交换树脂吸附法分辨率不好，产品纯度不够高；超滤法操作简单、无杂质引入，但制备过程中溶菌酶损失较大，最终得到酶收率较低，产品纯度低。由于溶菌酶洗脱液溶液量大、含盐量高，常用超滤设备负担重、超滤膜因长时间工作易受污染，膜的使用寿命受到很大的影响；同时蛋清中的大部分蛋白质被破坏，致使无法进行蛋清蛋白的后续加工应用。因此需要一种高效的溶菌酶制备工艺来满足市场需要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种溶菌酶的制备方法，该制备方法简单快捷，条件温和，无需复杂设备，可以克服现有溶菌酶制备工艺的缺点，获得高纯度与高生物活性的溶菌酶，且微生物含量低，产品安全性高；此外，在制备溶菌酶的同时还可以获得较高纯度的其它活性蛋白。
2、本专利技术通过下述技术方案实现：
3、一种溶菌酶的制备方法，对除杂处理后的蛋清的滤液依次进行deae阴离子树脂吸附交换、cm-琼脂糖弱酸性阳离子交换树脂层析柱吸附交换，然后将洗脱液进行冷冻干燥，获得溶菌酶；
4、其中，deae阴离子树脂吸附交换过程为：
5、在5～10℃下，将滤液ph调至6.0～8.0，然后加入到deae阴离子树脂中，搅拌吸附，分离去除水溶性的杂蛋白，收集滤液；
6、其中，cm-琼脂糖弱酸性阳离子交换树脂层析柱吸附交换为：
7、将经过deae阴离子树脂吸附交换后的滤液通过cm-琼脂糖弱酸性阳离子交换树脂层析柱，用磷酸盐缓冲液冲洗，用nacl溶液洗脱，收集洗脱液。
8、本专利技术连用树脂吸附交换法制备溶菌酶，通过调ph6.0～8.0，利用deae阴离子树脂去除大多数杂质蛋白，再采用高载量、高流速的cm-琼脂糖弱酸性阳离子交换树脂分离纯化；冷冻干燥避免使用有机溶剂，保护了酶的活力；从而制得获得高纯度、高活性、高安全性的溶菌酶产品。
9、本专利技术通过采用两次树脂吸附交换工艺，不仅可以获得高纯度目标产物溶菌酶，还可以获得高活性的大分子蛋白(卵白蛋白、卵转铁蛋白)，进而提高了包括鸡蛋在内的禽蛋综合利用的广度和深度。
10、并且，本专利技术简单快捷，条件温和，无需复杂设备，本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产
11、进一步地，包括以下步骤：
12、步骤一、获取蛋清，并去除杂质；
13、步骤二、对步骤一获取的蛋清进行稀释处理获得稀释液，向稀释液中添加nacl，然后调节稀释液的ph值至3.0～6.0；搅拌30～60min，静置过滤收集上清液；
14、步骤三、向步骤二获得的上清液中加入吸附剂，搅拌30～60min，经滤纸过滤收集滤液；
15、步骤四、在5～10℃下，将步骤三的滤液ph调至6.0～8.0，加入deae阴离子树脂，搅拌吸附3～7h，静置分层，收集滤液，分离去除水溶性的杂蛋白；
16、步骤五、将步骤四获得的滤液通过cm-琼脂糖弱酸性阳离子交换树脂层析柱，用磷酸盐缓冲液冲洗，然后用含nacl溶液洗脱，收集洗脱液；
17、步骤六、将步骤五获得的洗脱液ph值调至5.0～7.0，然后冷冻干燥，即得溶菌酶。
18、进一步地，步骤一中，蛋清包括鸡蛋清，鸡蛋清的获取过程为：去除蛋黄，收集鸡蛋清，经细网漏筛过滤，除去蛋清液残留中的杂质；
19、进一步地，步骤二中，蛋清中加入1～6倍的去离子水进行稀释，稀释液中nacl的最终浓度为0.05～0.08mol/l。
20、进一步地，步骤二中，采用乙酸调节ph，搅拌采用低速搅拌，搅拌速度为100r/min～200r/min。
21、进一步地，步骤三中，吸附剂包括硅藻土或珍珠岩，搅拌采用低速搅拌，搅拌速度为50r/min～150r/min。
22、进一步地，步骤三中，吸附剂的用量为步骤二获得的上清液重量的4％～8％。
23、进一步地，步骤四中，deae阴离子树脂与滤液的体积比为1:3～2:5。
24、进一步地，步骤五中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.03～0.10mol/l，ph为5.0～7.0，nacl溶液的浓度为0.3～0.5mol/l。
25、进一步地，步骤六中，如洗脱液中有白色沉淀，先通过离心除去白色沉淀，再冷冻干燥制备溶菌酶。
26、本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
27、1、专利技术通过采用两次树脂吸附交换工艺，不仅可以获得高纯度高活度目标产物溶菌酶，所得溶菌酶的比活力大于40000u/mg，产品纯度可达94％～96％，菌落总数＜5000cfu本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，对除杂处理后的蛋清的滤液依次进行DEAE阴离子树脂吸附交换、CM-琼脂糖弱酸性阳离子交换树脂层析柱吸附交换，然后将洗脱液进行冷冻干燥，获得溶菌酶；
2.根据权利要求1所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤一中，蛋清包括鸡蛋清，鸡蛋清的获取过程为：去除蛋黄，收集鸡蛋清，经细网漏筛过滤，除去蛋清液残留中的杂质。
4.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤二中，蛋清中加入1～6倍的去离子水进行稀释，稀释液中NaCl的最终浓度为0.05～0.08mol/L。
5.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤二中，采用乙酸调节pH，搅拌采用低速搅拌，搅拌速度为100r/min～200r/min。
6.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤三中，吸附剂包括硅藻土或珍珠岩，搅拌采用低速搅拌，搅拌速度为50r/min～150r/min。
7.根据权利要求2
8.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤四中，DEAE阴离子树脂与滤液的体积比为1:3～2:5。
9.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤五中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.03～0.10mol/L，pH为5.0～7.0，NaCl溶液的浓度为0.3～0.5mol/L。
10.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤六中，如洗脱液中有白色沉淀，先通过离心除去白色沉淀，再冷冻干燥制备溶菌酶。
...【技术特征摘要】
1.一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，对除杂处理后的蛋清的滤液依次进行deae阴离子树脂吸附交换、cm-琼脂糖弱酸性阳离子交换树脂层析柱吸附交换，然后将洗脱液进行冷冻干燥，获得溶菌酶；
2.根据权利要求1所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤一中，蛋清包括鸡蛋清，鸡蛋清的获取过程为：去除蛋黄，收集鸡蛋清，经细网漏筛过滤，除去蛋清液残留中的杂质。
4.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤二中，蛋清中加入1～6倍的去离子水进行稀释，稀释液中nacl的最终浓度为0.05～0.08mol/l。
5.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤二中，采用乙酸调节ph，搅拌采用低速搅拌，搅拌速度为100r/min～200r/min...
【专利技术属性】
技术研发人员：周后杰，张忠元，张革，唐章勇，肖勇，陈云，蒋维涛，武梦霞，王倩，余露，
申请(专利权)人：四川德博尔制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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