【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及固定化酶生物催化剂的制备及应用，具体涉及一种zn-nimof材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用。
技术介绍
1、人参皂苷为三萜皂苷，是人参的主要活性成分，具有抗衰老、抗氧化和抗癌等特性，由于其独特的三萜骨架与不同的糖基相互作用而产生的结构多样性，使得人参皂苷表现出多种生物活性。人参皂苷rh2，又称3-o-β-d-glucopyranosyl-protopanaxadiol，是一种价格昂贵且稀有的ppd型人参皂苷。其在癌症治疗中具有抗增殖、抗侵袭、抗转移、诱导细胞周期阻滞和促进分化等作用，但人参提取物中人参皂苷rh2含量极低(总干重0.0001％～0.0003％[w/w])。因此，人参皂苷rh2的合成受到了广泛的关注。
2、人参皂苷rh2的制备方法包括植物提取法、化学合成法和合成生物学构建细胞工厂法。然而，这些方法不环保，产量低，无法工业化。相比之下，酶催化转化法绿色高效，是实现人参皂苷rh2工业化生产的一种很有前景的方法。ppd被葡萄糖或其他糖在c3或c20位置糖基化，从而产生ppd型人参皂苷rh2。糖基化过程中使用的生物合成酶尿苷二磷酸(udp)-糖基转移酶(ugt)可通过形成o-β1,2-或o-β1,6-糖苷键合成多种人参皂苷。
3、ugts是自然界常见的酶，广泛用于低聚糖、多糖、糖缀合物和新型衍生物的合成，是生物合成人参皂苷rh2最后一步的关键酶。但是，直接使用游离酶催化反应面临两个问题：一是工程菌表达后，需要对粗酶进行纯化(如果不进行纯化，粗酶中的糖苷酶会将糖基化的ppd再次去
4、金属有机骨架(mof)因其高比表面积、可调节和超高孔隙率、可设计的功能和良好的热稳定性而被广泛应用。现有的mof固定方法包括物理吸附法、共价交联法和共沉淀法。上述方法存在以下缺点：酶在催化过程中容易脱落，使用交联剂导致酶活性丧失，并且需要高纯度的酶，这大大增加了固定化过程的难度和成本。为此，本专利技术提供一种zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用，不仅克服了现有合成人参皂苷rh2时直接使用ugts催化时对粗酶纯化过程复杂、时间长且会降低酶活性以及催化过程需要严格控制ph的问题，而且解决了采用mof材料固定化ugts导致的催化过程酶易脱落、酶失活以及增加固定化过程难度和成本的技术问题，同时提供了一种能够实现较高的人参皂苷rh2转化率的具有更好的温度、ph和储存稳定性的固定化糖基转移酶。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3、s1，制备zn-ni mof：将可溶性锌盐和可溶性镍盐溶解于dmf和乙二醇的混合液中，加入有机配体，磁力搅拌，得到混合物，将所述混合物转移到聚四氟乙烯反应釜中，于110～150℃下保温，得到沉淀物，洗涤，干燥，得到黄棕色zn-ni mof粉末；
4、s2，将s1的zn-ni mof粉末与含有糖基转移酶的细胞裂解液于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于冰水浴磁力搅拌，离心，得到zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶(ugt@zn-ni mof)。
5、ph＝7.4的磷酸盐缓冲液的配置：缓冲液中含137mmol/lnacl，2.7mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4，2mmol/lkh2po4。称取7.946g的nacl，0.201g的kc1，3.581g的na2hpo4，0.272g的kh2po4配置成1000ml的溶液，调节ph至7.4即得。
6、作为优选的实施方式，s1中，所述可溶性锌盐与可溶性镍盐的摩尔比为1:0.3～3。
7、作为优选的实施方式，s1中，所述可溶性锌盐和可溶性镍盐与有机配体的摩尔比为1:0.25～4。
8、作为优选的实施方式，s1中，所述可溶性锌盐为硝酸锌，所述可溶性镍盐为硝酸镍。
9、作为优选的实施方式，s1中，所述有机配体包括对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸。
10、作为优选的实施方式，s1中，所述保温的时间为4～8h，搅拌的时间为2.5h。
11、作为优选的实施方式，s2中，所述zn-ni mof粉末与含有糖基转移酶的细胞裂解液的用量比为10mg：0.1～1.0ml。
12、作为优选的实施方式，s2中，所述糖基转移酶为从枯草芽孢杆菌sl-44基因组中挖掘出的糖基转移酶基因ge02773，构建糖基转移酶表达工程菌bl21-ge02773-28a，最后诱导其表达的可溶性蛋白ugt。
13、具体为：向200ml的液体培养基中依次加入200μl卡那和4ml菌液，在37℃培养箱中振荡培养至od595nm＝0.6～0.8后，加入200μliptg进行诱导表达，在16℃培养箱中振荡培养12-16h。
14、粗酶液提取过程：将诱导表达后的菌液在4℃下8000rpm离心3min，用ph＝7.4的pbs缓冲液清洗两次后，再加入20mlpbs缓冲液，用细胞破碎仪进行细胞破碎，细胞破碎仪工作参数为：工作时间5s，间隔时间5s，工作总时长20min。最后，在4℃下12000rpm离心10min得到粗酶液。
15、作为优选的实施方式，s2中，所述冰水浴的温度为4℃。
16、本专利技术的第二个目的在于提供一种上述制备方法制备得到的zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶(ugt@zn-ni mof)。
17、本专利技术的第三个目的在于提供一种zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶在合成人参皂苷rh2中的应用，其特征在于，所述应用为：按照3:1.2:10的质量比将尿苷二磷酸葡萄糖与原人参二醇和zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后采用正丁醇萃取，得到人参皂苷rh2。
18、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
19、(1)本专利技术提供了一种zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶的制备方法，本专利技术能够有效地完成金属离子和有机配体的组装，以溶剂热法在150℃下合成了高度稳定的介孔zn-ni mof纳米颗粒，再采用介孔zn-ni mof纳米颗粒一步纯化和固定化糖基转移酶(ugt)，由于金属离子和ugt酶蛋白分子中组氨酸上的咪唑基团之间的螯合作用，实现了从粗酶液中一步纯化和固定化糖基转移酶，固定化后的ugt具有更好的ph适应性、热稳定性、优越的重复使用性和储存稳定性，经过在合成人参皂苷rh2的应用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐与可溶性镍盐的摩尔比为1:0.3～3。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐和可溶性镍盐与有机配体的摩尔比为1:0.25～4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐为硝酸锌，所述可溶性镍盐为硝酸镍。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机配体包括对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保温的时间为4～8h，所述搅拌的时间为2.5h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Zn-Ni MOF粉末与含有糖基转移酶的细胞裂解液的用量比为10mg：0.1～1.0mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述糖基转移酶为从枯草芽孢杆菌SL-44基因组中挖掘出的糖基转移酶基因GE02773，构建糖基转移酶表达工程菌BL21-GE027
9.一种含权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶。
10.一种权利要求9所述的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶在合成人参皂苷Rh2中的应用，其特征在于，所述应用为：按照3:1.2:10的质量比将尿苷二磷酸葡萄糖、原人参二醇和Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后采用正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
...【技术特征摘要】
1.一种zn-ni mof材料固定化的糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐与可溶性镍盐的摩尔比为1:0.3～3。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐和可溶性镍盐与有机配体的摩尔比为1:0.25～4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐为硝酸锌，所述可溶性镍盐为硝酸镍。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机配体包括对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保温的时间为4～8h，所述搅拌的时间为2.5h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述zn-ni mof粉末与含有...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘啸尘，李志燕，武占省，张宇飞，岳骏松，田飞，何艳慧，石怀琪，涂旻，
申请(专利权)人：西安工程大学，
类型：发明
国别省市：
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