【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和酶工程，尤其是涉及一种甲醇脱氢酶突变体及其应用。
技术介绍
1、甲醇作为一种低碳原料，来源丰富、成本低廉，构建人工合成的甲基代谢模式是近年来合成生物学领域兴起的拓宽生物制造原料来源的一个新兴方向。nad+-依赖型甲醇脱氢酶是甲醇氧化为甲醛的首选催化元件，因为反应过程中生成的nadh可作为宿主菌合成代谢的还原力，同时实现nad+的再生，且该反应在有氧和无氧条件下均可进行。已有报道利用nad+-依赖型甲醇脱氢酶作为第一个催化元件成功构建甲基代谢型的c.glutamicum，e.coli等(guo et al.2022,bioresources and bioprocessing,9:62；gan etal.2023engineering microbiology,3:100081)。
2、nadh和nadph是细胞内两种重要的还原力，对于部分还原性产物的生成，nadph的含量至关重要，比如合成1mol赖氨酸需要4mol nadph。所以在合成生物学中，还原力nadph的生成往往是影响产物产量的重要因素之一。在以nad+-依赖型甲醇脱氢酶(methanoldehydrogenase,mdh)和rump(ribulose monophosphate)途径构建的甲基代谢型e.coli中，通过共表达来自于酿酒酵母的nadh-激酶(pos5p)将代谢途径中的nadh转化为nadph，将e.coli生产赖氨酸的产量提高一倍(wang xin et al.2019,biotechnology forbiofue
3、目前已报道的天然甲醇脱氢酶均为nad+-依赖型，在甲醇氧化过程中催化nad+生成nadh。文献报道的能够以nadp+为辅酶催化甲醇氧化的仅有来源于bacillus methanolicus的甲醇脱氢酶bmmdh和bmmdh2的单位点突变体bmmdhd38g与bmmdh2d41g，以及来源于desulfotomaculum kuznetsovii的adhdk的突变体d43g(a.m.ochsner et al.2014,febsletters,588:2993)。且bmmdhd38g，bmmdh2d41g和adhdkd43g以nadp+为辅酶的活力远低于以nad+为辅酶的活力，分别为24％，14％和16％。
4、不同的代谢产物对于细胞内nadh和nadph的需求不同，在菌株构建时需根据最终产物的合成需求对细胞内nadh和nadph进行调节。作为甲基代谢型工程菌构建的关键元件，甲醇脱氢酶的辅酶依赖性是影响细胞内还原力nadh和nadph比例的重要因素之一。因此，有必要开发不同辅酶依赖性的甲醇脱氢酶，便于合成生物学家根据最终产物的合成需求选择合适的甲醇脱氢酶与下游代谢途径进行适配。
技术实现思路
1、现有技术中天然甲醇脱氢酶均为nad+-依赖型，而能够以nadp+为辅酶催化甲醇氧化的突变体的活力又远低于以nad+为辅酶的突变体的活力，基于该技术现状，本专利技术的目的在于提供一种甲醇脱氢酶突变体及其应用。本专利技术提供的系列甲醇脱氢酶突变体，在催化甲醇氧化的过程中表现出不同的辅酶偏好性，拓展其在甲基代谢型工程菌构建中的应用。
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
3、本专利技术首先提供一种甲醇脱氢酶突变体，所述甲醇脱氢酶突变体是以氨基酸序列如seq id no.2所示的甲醇脱氢酶为亲本，将亲本第40～47位和/或第68～73位突变和/或第184～185位突变。
4、在本专利技术的一个实施方式中，所述突变体选择如下的(a)～(g)中的任一种：
5、(a)将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第40～47位tdaglhsl突变为ygggsvkkt后的新氨基酸序列对应的酶；
6、(b)将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第68～73位pkaepnpt突变为ggiepnpa后的新氨基酸序列对应的酶；
7、(c)将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第184位g突变为t，并将第185位m突变为l后的新氨基酸序列对应的酶；
8、(d)将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第40～47位tdaglhsl突变为ygggsvkkt，第68～73位pkaepnpt突变为ggiepnpa后的新氨基酸序列对应的酶；
9、(e)将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第40～47位tdaglhsl突变为ygggsvkkt，第184位g突变为t，并将第185位m突变为l后的新氨基酸序列对应的酶；
10、(f)将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第68～73位pkaepnpt突变为ggiepnpa，第184位g突变为t，并将第185位m突变为l后的新氨基酸序列对应的酶；
11、(g)将如seq id no.2所示的氨基酸序列的第40～47位tdaglhsl突变为ygggsvkkt，第68～73位pkaepnpt突变为ggiepnpa，第184位g突变为t，并将第185位m突变为l后的新氨基酸序列对应的酶。
12、其中，甲醇脱氢酶突变体(a)命名为m1；甲醇脱氢酶突变体(b)命名为m2；甲醇脱氢酶突变体(c)命名为m4；甲醇脱氢酶突变体(d)命名为m12；甲醇脱氢酶突变体(e)命名为m14；甲醇脱氢酶突变体(f)命名为m24；甲醇脱氢酶突变体(g)命名为m124。
13、本专利技术还进一步提供编码所述甲醇脱氢酶突变体的基因。其来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述甲醇脱氢酶突变体的基因序列进行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述甲醇脱氢酶突变体的核酸分子。
14、本专利技术还进一步提供携带所述基因的重组载体。所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，将本专利技术所述甲醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列连接于各种空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述优选质粒载体为pet-21a(+)质粒。
15、本专利技术还进一步提供表达所述甲醇脱氢酶突变体，或携带所述重组质粒的重组表达转化体。可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甲醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体选择如下的(a)～(g)中的任一种：
2.编码权利要求1所述甲醇脱氢酶突变体的基因。
3.编码权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pET-21a(+)质粒。
5.表达权利要求1所述甲醇脱氢酶突变体，或携带权利要求2所述重组质粒的重组表达转化体。
6.根据权利要求5所述的重组表达转化体，其特征在于，制备重组表达转化体的宿主细胞为大肠杆菌。
7.甲醇脱氢酶突变体催化剂，其特征在于，所述甲醇脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
8.权利要求1所述甲醇脱氢酶突变体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体、权利要求5所述重组表达转化体或权利要求7所述甲醇脱氢酶突变体催化剂在催化甲醇氧化中的应用。
9.一种催化醇生成醛的方法，其特征在于，所述方法为以权利要求1所述甲醇脱氢酶突变体或权利要求7所述甲醇脱氢酶突变体催化剂作为催化甲醇氧化生成醛的催化剂，且以NADP+和/或NAD+为辅酶。<...
【技术特征摘要】
1.一种甲醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体选择如下的(a)～(g)中的任一种：
2.编码权利要求1所述甲醇脱氢酶突变体的基因。
3.编码权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pet-21a(+)质粒。
5.表达权利要求1所述甲醇脱氢酶突变体，或携带权利要求2所述重组质粒的重组表达转化体。
6.根据权利要求5所述的重组表达转化体，其特征在于，制备重组表达转化体的宿主细胞为大肠杆菌。
7.甲醇脱氢酶突变体催化剂，其特征在于，所述甲醇脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
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