【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原菌检测生物，具体涉及一种一管法同时检测两种向日葵茎部真菌病害的检测试剂盒及使用方法。
技术介绍
1、向日葵是我国重要的油料作物之一，栽培面积仅次于大豆和油菜，不仅具有重要的经济价值，还有观赏价值、药用价值。向日葵黑茎病菌(leptosphaeria lindquistii)和向日葵茎溃疡病菌(diaporthe helianthi)是侵染向日葵茎部的两种毁灭性有害生物，分别于2007年和2010年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。为防止检疫性有害生物的传入及扩散，需持续加强进境向日葵检验检疫和田间种植监测。
2、目前针对向日葵种子的病菌检疫鉴定，大多按照出入境检验检疫行业标准《向日葵黑茎病菌检疫鉴定方法》(sn/t 3174-2012)和《向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法》(gb/t31792-2015)，分别进行检查。检查方法包括症状检查、分离培养有疑似症状的带病组织、单菌落挑选和纯化、显微镜观察、核酸提取、通用引物常规pcr并测序、特异性引物和探针的实时荧光pcr检测等步骤，整个过程不仅耗时长，而且需要专业技术人员进行形态学鉴定以及专门的实验室仪器进行分子鉴定，不适合在田间对向日葵检疫性真菌病害进行快速筛查与检测。
3、针对发生在同样部位、具有相似症状的植物病原物进行同时检测和特异性鉴定，具有相当难度和挑战性。现有技术曾报道采用三重pcr技术同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌(cn 102943118 b：同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重pcr引物及
4、因此，建立一种快速、灵敏、同步检测向日葵茎部两种真菌病害的方法，不仅有效弥补现有技术的不足，还能为口岸快速检疫以及田间早期诊断提供新技术，具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术意在提供一种一管法同时检测两种向日葵茎部真菌病害的检测试剂盒及使用方法，以解决现有技术同时检测向日葵茎部的两种病原物灵敏度不高的技术问题。
2、为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒，包括rpa扩增体系、crispr/cas检测体系和侧向流试纸条；所述rpa扩增体系包括li-f/li-r引物对和dh-f/dh-r引物对，所述li-f/li-r引物对包括seq id no.1和seq id no.2；dh-f/dh-r引物对包括seq id no.3和seq id no.4；所述crispr/cas检测体系包括crispr/cas12a和crispr/cas13a。
3、本方案的原理及优点是：
4、1、相比于现有技术中因两种dna同时扩增容易出现“污染”现象使得检测结果不准确而言，本方案通过优化设计两对引物，即li-f/li-r引物对和dh-f/dh-r引物对，其中li-f/li-r引物对扩增向日葵黑茎病菌基因组核酸，得到dna扩增产物；而通过在dh-f/dh-r引物对中添加“ggg”的启动子序列，使得该引物扩增向日葵茎溃疡病菌基因组核酸的同时，得到rna扩增产物；如此，便于在同时扩增时分别形成靶定于向日葵黑茎病菌核酸的dna产物和向日葵茎溃疡病菌核酸的rna产物，从而可以采用2种检测方式同时对2种目标病原物进行检测，避免相互干扰扩增结果。
5、2、本专利技术利用crispr/cas12(cpf1)和crispr/cas13(c2c2)特异性识别核酸的特性，分别识别向日葵黑茎病菌的dna产物和向日葵茎溃疡病菌的rna产物，同时切割相应的报告分子，形成不同的切割产物，再通过侧向流试纸条(胶体金试纸条)上的不同抗体对切割产物的捕获，直接读取检测结果，实现对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡菌的基因组核酸的同时检测，具有高灵敏度、高特异性及快速可视化检测的优点。
6、优选的，所述rpa扩增体系包括扩增反应酶干粉(包含bsu聚合酶、重组酶、单链dna结合蛋白和dntp混合物)、酶干粉溶解缓冲液、醋酸镁和转录试剂，所述转录试剂包括t7rnapolymerase mix，ntp buffer mix，二硫苏糖醇(dtt)；所述转录试剂与rpa扩增体系试剂放置于同管不同位置。
7、有益效果：本方案采用上述设置，便于在扩增样品dna时，通过翻转或离心的方式将反应管盖子内侧转录试剂释放，即可快速扩增-转录反应获得向日葵茎溃疡病菌核酸的rna产物，使得向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的基因组核酸以不同形式扩增富集，便于同时对两种病菌进行检测，提高检测效率。
8、优选的，所述crispr/cas检测体系还包括1×nebuffer 3.1(10mm nacl,5mmtris-hcl,1mm mgcl2,10μg/ml)、li crrna、dh crrna、探针和无酶无菌水。
9、有益效果：本方案采用上述设置，便于扩增产物在crispr/cas检测体系中被特异性识别的同时启动crispr/cas的单碱基切割活性而切割报告分子，从而放大扩增产物信号而被侧向流试纸条或荧光检测仪识别。
10、优选的，所述报告分子包括胶体金试纸条报告分子或荧光报告分子。
11、有益效果：本方案采用上述设置，便于以荧光检测仪(包括手持式荧光笔)或者胶体金试纸条上的抗体检测crispr/cas检测体系中的切割产物，从而快速识别检测样品中是否含有向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌核酸中的一种或两种，实现向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的快速同时检测。
12、优选的，所述侧向流试纸条上包含抗体标记金纳米、链霉亲和素、地高辛抗体和羊抗鼠二抗(igg)，侧向流试纸条报告分子包括侧向流试纸条dna报告分子和侧向流试纸条rna报告分子，所述侧向流试纸条dna报告分子的序列为供cas12a剪切的5'-抗原分子-ccccccccccccccc-biotin-3'，所述侧向流试纸条rna报告分子的序列为供cas13a切割的5'-抗原分子-uuuuuuuuuuuuuuu-biotin-3'，所述抗原分子为抗原分子为羧基荧光素(fam)、荧光素5-异硫氰酸酯(fitc)、四甲基罗丹明(tamra)、地高辛(dig)中任一种。
13、有益效果：本方案采用上述设置，便于在检测阶段，通过crispr/cas检测体系中的报告分子与侧向流试纸条上的金标抗体特异性结合，形成的大分子被试纸条上控制线、检测线上位置的不同分子捕获，形成特异性条带，从而便于快速辨别检测样品中水会否含有目标菌(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒，其特征在于：包括RPA扩增体系、CRISPR/Cas检测体系和侧向流试纸条；所述RPA扩增体系包括LI-F/LI-R引物对和DH-F/DH-R引物对，所述LI-F/LI-R引物对包括Seq ID No.1和Seq ID No.2；DH-F/DH-R引物对包括Seq ID No.3和Seq ID No.4；所述CRISPR/Cas检测体系包括CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a。
2.根据权利要求1所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述RPA扩增体系还包括扩增反应酶干粉、扩增缓冲液、醋酸镁和转录试剂，所述转录试剂包括T7 RNA Polymerase Mix，NTP Buffer Mix，二硫苏糖醇；所述转录试剂与RPA扩增体系中其他试剂放于同一反应管的不同位置。
3.根据权利要求2所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas检测体系还包括1×NEBuffer 3.1、LI crRNA、
4.根据权利要求3所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述探针包括侧向流试纸条报告分子或荧光探针。
5.根据权利要求4所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述侧向流试纸条上包含抗体标记金纳米、链霉亲和素、地高辛抗体和羊抗鼠二抗，侧向流试纸条报告分子包括侧向流试纸条DNA报告分子和侧向流试纸条RNA报告分子，所述侧向流试纸条DNA报告分子的序列为供Cas12a剪切的5'-抗原分子-CCCCCCCCCCCCCCC-Biotin-3'，所述侧向流试纸条RNA报告分子的序列为供Cas13a切割的5'-抗原分子-UUUUUUUUUUUUUUU-Biotin-3'，所述抗原分子为FAM、FITC、罗丹明、地高辛中任一种。
6.根据权利要求5所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述荧光探针包括荧光DNA报告分子和荧光RNA报告分子，所述荧光DNA报告分子的序列为供Cas12a剪切的5'-荧光基团-CCACC-淬灭基团-3'；所述荧光RNA报告分子的序列为供Cas13a切割的5'-荧光基团-UUUUU-淬灭基团-3'，所述荧光基团为FAM、FITC、菁染料或其它与检测器激发波长和发射波长匹配的荧光基团；所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、其它可淬灭荧光基团的物质。
7.根据权利要求6所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述Cas12a识别的靶向序列的LI crRNA为LI-crRNA1或LI-crRNA2，所述LI-crRNA1为Seq ID No.5，所述LI-crRNA2为Seq ID No.6；所述Cas13a识别的靶向序列的DH crRNA为DH-crRNA，所述DH-crRNA为Seq ID No.7。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒的使用方法，基于上述一管法同时检测向日葵茎部病害的检测试剂盒完成，其特征在于：包括将待测样品DNA添加至RPA扩增体系中扩增获得扩增产物后，将扩增产物添加进CRISPR/Cas检测体系中获得包含切割片段的检测溶液，再通过侧向流试纸条或荧光检测仪对检测溶液中结果进行显示。
...【技术特征摘要】
1.一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒，其特征在于：包括rpa扩增体系、crispr/cas检测体系和侧向流试纸条；所述rpa扩增体系包括li-f/li-r引物对和dh-f/dh-r引物对，所述li-f/li-r引物对包括seq id no.1和seq id no.2；dh-f/dh-r引物对包括seq id no.3和seq id no.4；所述crispr/cas检测体系包括crispr/cas12a和crispr/cas13a。
2.根据权利要求1所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述rpa扩增体系还包括扩增反应酶干粉、扩增缓冲液、醋酸镁和转录试剂，所述转录试剂包括t7 rna polymerase mix，ntp buffer mix，二硫苏糖醇；所述转录试剂与rpa扩增体系中其他试剂放于同一反应管的不同位置。
3.根据权利要求2所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述crispr/cas检测体系还包括1×nebuffer 3.1、li crrna、dhcrrna、探针和无酶无菌水。
4.根据权利要求3所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述探针包括侧向流试纸条报告分子或荧光探针。
5.根据权利要求4所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述侧向流试纸条上包含抗体标记金纳米、链霉亲和素、地高辛抗体和羊抗鼠二抗，侧向流试纸条报告分子包括侧向流试纸条dna报告分子和侧向流试纸条rna报告分子，所述侧向流试纸条dna报告分子的序列为供cas12a剪切的5'-抗原分...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷荣，吴品珊，邝瑞瑞，孙夕雯，王新一，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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