葡萄的再生系统及其应用技术方案

本发明专利技术特征性描述了由胚胎发生细胞或胚胎发生培养物产生植株或成熟体细胞胚的方法。所述方法包括以下步骤：（ａ）提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；（ｂ）从所述培养物回收胚胎发生细胞；（ｃ）将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和（ｄ）由所述胚胎发生细胞生长出葡萄成熟体细胞胚。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
葡萄的再生系统及其应用的制作方法
技术介绍
本专利技术涉及使葡萄植株再生的方法和用这种方法产生的葡萄种质。葡萄藤是具有古老起源的温带落叶水果作物。葡萄产量(6×106公吨)超过了任何其它温带水果作物的产量，在柑桔类和香蕉产量之后据第三位。另外，由于其在新鲜水果、果汁、果冻、葡萄干和葡萄酒方面的用途，葡萄的价值超过了所有其它水果作物。因此，改良葡萄的成功努力可能对工业化葡萄栽培具有重要影响。目前改良葡萄藤的方法是耗时费力的。例如，通过传统的育种进行的葡萄遗传改良受诸如结果期前(pre-bearing age)时间长和倍性水平改变的许多因素的严重限制。栽培葡萄也是高度杂合的，一般不能由种子纯育。而且，葡萄育种程序是昂贵的长期计划。尽管植物生物技术是葡萄遗传改良的一个有吸引力的替代方法(Kuksova等，Plant CellTiss.Org.Cult.4917-27，1997)，但仅当有有效的再生系统时，才能应用体外遗传操作。因此，减少任何这些问题的方法均代表本领域的重大进展。专利技术概述我们已经发现了使多年生葡萄胚胎发生培养物生长的方法和采用液体悬浮培养物在相对短时间内由这种多年生胚胎发生培养物生长大量葡萄体细胞胚的方法。本专利技术的方法提供几个优点。例如这些方法促进非常高频率的体细胞胚的形成和植物再生。先前尚未报道过任何已知的栽培品种的葡萄藤再生具有这种频率，这种频率使得该方法可用于大规模生产葡萄植株的克隆栽植材料。另外，所述方法产生的胚胎无诸如融合和体细胞胚扁化(fasciation)等常见的异常。本专利技术的方法也导致胚胎发生培养物起始频率提高，使得能够产生高胚胎发生培养物，这种高胚胎发生培养物然后可以成功地通过再生过程的随后阶段至完整植株水平。由于具有这些优点，本专利技术的方法尤其可用于应用这种作物遗传改良的生物技术。因此，第一方面，本专利技术特征性描述了产生成熟体细胞胚的方法。该方法包括以下步骤(a)提供包括胚胎发生细胞在内的液体培养物；(b)由该培养物回收胚胎发生细胞；(c)将胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄成熟体细胞胚。所述胚胎发生细胞最好得自花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。在再一优选实施方案中，步骤(a)的液体培养基包括植物生长调节物(例如生长素、NOA(萘氧乙酸)、吲哚-3-乙酸(IAA)、麦草畏、毒莠定(picloram)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、细胞分裂素、苄基腺嘌呤(BA)、噻二唑素(thidiazuron)、玉米素、脱落酸(ABA)或赤霉酸(GA)。在其它优选的实施方案中。起始培养基包括至少0.01mg/L细胞分裂素；至少0.1mg/L一种糖；和至少0.1mg/L含氮化合物。典型的糖包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和甘油。典型的含氮化合物包括硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵和硫酸铵。如果需要，可以用DNA(例如编码能够赋予抗病性的基因的DNA)转化所述胚胎发生细胞或体细胞胚。可以通过过滤、沉降或选择，从第一培养物回收所述胚胎发生细胞。另外，可以筛分第一培养物，以使分化的葡萄体细胞胚的形成同步。步骤(a)的胚胎发生细胞最好得自选自以下的来源按照第一方面的步骤(a)和(b)产生的胚胎发生细胞；按照第一方面的步骤(a)-(d)产生的葡萄体细胞胚；按照第一方面的方法产生的成熟体细胞胚；按照第五方面的小植株；和来自按照第一方面的方法产生的成熟体细胞胚产生的植物的花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。在优选实施方案中，该方法还包括将所述体细胞胚转移至萌发培养基以生长出葡萄小植株。在其它优选实施方案中，如果需要，在包括植物生长调节物在内的培养基上培养所述胚胎发生细胞。第二培养物可以是液体培养物或固体培养物。液体培养物的优选培养基包括B-5主要盐和MS次要盐。第二方面，本专利技术特征性描述了产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括以下一般步骤(a)提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；(b)从所述培养物中选择所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。第三方面，本专利技术特征性描述了产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括以下一般步骤(a)提供包含胚胎发生细胞和包括B-5主要盐和MS次要盐的培养基的液体培养物；(b)从所述培养物中回收所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。第四方面，本专利技术特征性描述了按照第一方面的方法产生的葡萄成熟体细胞胚。第五方面，本专利技术特征性描述了由第四方面的葡萄成熟体细胞胚产生的小植株。第六方面，本专利技术特征性描述了长期贮存葡萄成熟体细胞胚的方法。该方法包括将所述胚胎干燥并将所述胚胎贮存于低于8℃的温度的一般步骤。所述葡萄成熟体细胞胚最好用第一方面的方法产生。第七方面，本专利技术特征性描述了葡萄体细胞胚的直播方法。该方法包括将所述葡萄体细胞胚置于包含沙子和盆栽混合物的盆栽培养基中。第八方面，本专利技术特征性描述了用液体培养基由多年生葡萄胚胎发生培养物产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括的步骤是(a)在第一液体培养基中培养多年生葡萄胚胎发生培养物，以生长出细胞悬浮培养物，第一液体培养基包含一种植物生长调节物；(b)从所述细胞悬浮培养物回收胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团；和(c)在第二液体培养基中培养得自步骤(b)的细胞悬浮培养物的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团，以产生葡萄体细胞胚。在优选实施方案中，该方法还包括将葡萄体细胞胚转移至萌发培养基以生长出葡萄小植株。在第八方面的其它优选实施方案中，所述植物生长调节物为生长素、NOA、BA、玉米素、麦草畏、毒莠定、NAA、IAA、2，4-D、细胞分裂素、噻二唑素、ABA或GA。在另外的优选实施方案，将步骤(a)的液体细胞培养物传代培养，从所述细胞悬浮培养物回收所述葡萄细胞或葡萄细胞簇包括过滤、沉降或选择。在其它优选实施方案中，所述第二液体培养基还包括一种植物生长调节物(例如细胞分裂素)。可以筛分步骤(c)的液体细胞培养物，以使分化的葡萄体细胞胚的形成同步。如果需要，步骤(a)的葡萄体细胞胚或胚胎发生细胞可以各自用DNA转化。在步骤(b)中回收的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团也可以用DNA转化。同样，所述回收的体细胞胚可以用DNA转化。第九方面，本专利技术特征性描述了用固体培养基由多年生葡萄胚胎发生培养物产生葡萄体细胞胚的方法。该方法包括以下步骤(a)在第一液体培养基中培养胚胎发生细胞，以生长出细胞悬浮培养物，所述第一液体培养基包含一种植物生长调节物；(b)从所述细胞悬浮培养物回收胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团；和(c)在固体培养基中培养来自步骤(b)的细胞悬浮培养物的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团，以产生葡萄体细胞胚。在第九方面的优选实施方案中，所述固体培养基还包含一种植物生长调节物(例如细胞分裂素、ABA或GA)。在其它优选实施方案中，筛分所述回收的胚胎发生细胞或胚胎发生细胞团，以使葡萄成熟体细胞胚的形成同步。第十方面，本专利技术特征本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生成熟体细胞胚的方法，所述方法包括以下步骤：（ａ）提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；（ｂ）从所述培养物回收所述胚胎发生细胞；（ｃ）将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和（ｄ）由所述胚胎发生细胞生长出成熟体细胞胚。

【技术特征摘要】
US 1998-5-29 09/087,285;US 1998-5-15 60/085,7111.产生成熟体细胞胚的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；(b)从所述培养物回收所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出成熟体细胞胚。2.权利要求1的方法，其中所述胚胎发生细胞得自花药、子房、胚珠、花组织、营养组织、蔓、叶、根、珠心组织、茎、种子、原生质体、中柱鞘、顶端分生组织、胚胎发生组织、体细胞胚或合子胚。3.权利要求1的方法，其中所述第二培养物包含含有植物生长调节物的培养基。4.权利要求3的方法，其中所述植物生长调节物为生长素、NOA、麦草畏、毒莠定、NAA、IAA、2，4-D、细胞分裂素、苄基腺嘌呤、玉米素、噻二唑素、脱落酸或赤霉酸。5.权利要求1的方法，其中所述胚胎发生细胞用DNA转化。6.权利要求1的方法，还包括(e)将所述成熟体细胞胚转移至萌发培养基，以生长出葡萄小植株。7.产生葡萄体细胞胚的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供包含胚胎发生细胞的液体培养物；(b)从所述培养物中选择所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。8.产生葡萄体细胞胚的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供一种液体培养物，所述液体培养物包含胚胎发生细胞以及包含B-5主要盐和MS次要盐的培养基；(b)从所述培养物中回收所述胚胎发生细胞；(c)将所述胚胎发生细胞转移至第二培养物；和(d)由所述胚胎发生细胞生长出葡萄体细胞胚。9.权利要求1的方法，其中所述回收的葡萄体细胞胚用DNA转化。10.权利要求1的方法，其中所述液体培养物包含B-5主要盐和MS次要盐。11.权利要求1的方法，其中所述第二培养物为液体培养物。12.权利要求1的方法，其中从所述培养物中回收所述胚胎发生细胞包括过滤、沉降或选择。13.权利要求1的方法，其中筛分所述第一培养物，以使分化的葡萄体细胞胚的形成同步化。14.权利要求1的方法，其中所述第二培养物包含固体培养基。15.按照权利要求1的方法产生的葡萄成熟...

【专利技术属性】
技术研发人员：DJ格雷，J苏布拉马尼安，RE利茨，
申请(专利权)人：佛罗里达大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]