【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及天然产物领域。更具体地说，本专利技术涉及一种低分子量hg型果胶的制备方法及其构象表征。
技术介绍
1、植物源酸性多糖是目前应用和来源最广、制备和结构鉴定最为复杂的多糖，在近些年的食品和药用科学研究中的地位凸显。果胶是植物细胞壁的主要成分之一，分布广泛，被认为是自然界中结构最为复杂的酸性杂多糖，已被世界卫生组织食品添加剂联合委员会批准的一种食品添加剂，植物细胞壁富含果胶，尤其是同型半乳糖醛酸聚糖（hg）型果胶和鼠李半乳糖醛酸聚糖-i（rg-i）型果胶。hg型果胶主要以高含量的半乳糖醛酸构成，而rg-i型果胶是具有严格交替的鼠李糖和半乳糖醛酸序列的果胶片段。此外，还有少量的鼠李半乳糖醛酸聚糖-ii（rg-ii）型果胶，且主链侧链结构极为复杂，因此目前的研究以hg型果胶和rg-i型果胶为主。
2、近年来，学者们通过化学法、酶解法等从果蔬原料果胶中提取果胶寡糖，使其产生分子量较低且富含rg的结构片段，从而提高果胶的生物活性和生物利用率，关于hg型果胶的制备方法以淀粉酶酶解法为主，所得产物结构不均一，导致其精细结构鉴定较为困难，故亟待提供一种低分子量hg型果胶的制备方法。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
2、本专利技术还有一个目的是提供一种低分子量hg型果胶的制备方法，其利用水热法联合分级醇沉法提取果胶粗多糖，通过两步定向酶解有效破坏果胶分子结构，获得高纯度且均一的hg型果胶，为果胶杂多糖的结构鉴定
3、为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种低分子量hg型果胶的制备方法，包括以下步骤：
4、步骤一、采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶粗多糖；
5、步骤二、将果胶粗多糖先采用复合糖苷酶进行一级定向酶解，得到一级酶解多糖，将一级酶解多糖采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解，经纯化得到低分子量hg型果胶。
6、优选的是，果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻8-16 h，然后粉碎并过600-800 µm筛，再置于压力为0.37 mbar、温度为25-35℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
7、优选的，采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/l的盐酸溶液调节ph至2-4，再升温至40-80℃并保温2-6 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1:30-50。
8、优选的，分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为30-45%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为50-60%，静置12 h，再取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为65-80%，静置12 h，取沉淀物，将沉淀物装入截留分子量为3500da的透析袋中并置于去离子水中，在24℃条件透析36-72h，得到果胶粗多糖。
9、优选的，采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-l-阿拉伯聚糖内切酶、β-d-半乳糖苷酶、β- (1→4)-d-半乳聚糖内切酶加入果胶粗多糖中酶解，酶解4-20 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用凝胶色谱柱和阴离子交换柱纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-l-阿拉伯聚糖内切酶、β-d-半乳糖苷酶、β- (1→4)-d-半乳聚糖内切酶四种酶的用量均为100-300 u/ml果胶粗多糖。
10、优选的，采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解的方法为：将一级酶解多糖溶解在0.02-0.5 mol /l乙酸钠缓冲溶液中，并向体系中加入内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶，置于50℃条件下酶解1-2 h，得到二级酶解多糖，二级酶解多糖经真空浓缩除去75-85%的液体，冻干并研磨，得到低分子量hg型果胶，其中，内切多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶两种酶的用量均为0.2-1.0 u/ml一级酶解多糖。
11、优选的，一级酶解多糖在进行二级定向酶解前先进行预处理，预处理的方法为：将一级酶解多糖采用截流分子量10 kda的超滤膜进行分级，然后再置于离心机中以8000-10000 r·min-1转速离心10-20 min，回收超滤渗余物，进行二级定向酶解。
12、优选的，二级定向酶解采用超高压灭酶，灭酶的条件为：压力400-600 mpa，温度40-65℃。
13、本专利技术另外还提供了一种低分子量hg型果胶的构象表征，采用分光光度计测定果胶半乳糖醛酸含量、及果胶酯化羧基的含量，分析低分子量hg型果胶的酯化度；使用高效体积排阻色谱联合十八角度激光散射仪，以氯化钠为洗脱液测定低分子量hg型果胶的分子量及其分布；采用高效阴离子色谱仪，测定低分子量hg型果胶的中性糖组成和含量；采用傅立叶变换红外光谱仪分析低分子量hg型果胶中官能团类型；采用小角度x射线散射技术分析低分子量hg型果胶的空间构象参数；采用高场核磁共振仪分析的糖链化学结构；表征低分子量hg型果胶的空间构象。
14、优选的是，低分子量hg型果胶构象表征的方法包括以下步骤：
15、a1、计算低分子量hg型果胶的酯化度、分子量、中性糖含量、分子链线性度及支链结构域的贡献率、多分散指数、分子链的链长和链宽及空间构象参数，空间构象参数包括平均回旋半径、流体力学半径、非均向性构型、构象类型指数、持续长度、特征比；
16、a2、将步骤a1中的参数输入建模软件polys，结合低分子量hg型果胶糖链化学结构，并利用存储在 monobank 数据库中和glyclink 数据库中的单糖和糖苷键的结构信息，构建低分子量hg型果胶的三维结构模型，表征低分子量hg型果胶的空间构象。
17、本专利技术至少包括以下有益效果：
18、本专利技术利用水热法联合分级醇沉法提取果胶粗多糖，可在不破坏果胶分子结构的基础上获得分子量较小的果胶粗多糖；本专利技术通过一级定向酶解，可实现精准分离果胶中的hg组分，将其进行二级定向酶解，可进一步降低hg组分的分子量；本专利技术将一级酶解后的hg组分进行超滤分级，截留分子量控制在10 kda，可获得均一性良好的hg型果胶；以适用于其他富含果胶的果蔬副产物为原料，通过本专利技术的方法制备的低分子量hg型果胶经多元分析检测手段，可获得精细结构信息和空间构象模型。
19、本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
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1.低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻8-16 h，然后粉碎并过600-800 µm筛，再置于压力为0.37 mbar、温度为25-35℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
3.如权利要求1所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/L的盐酸溶液调节pH至2-4，再升温至40-80℃并保温2-6 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1:30-50。
4.如权利要求2所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为30-45%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙
5.如权利要求1所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：向果胶粗多糖中加入蒸馏水，配置成浓度为1-2.5 %（w/v）的果胶粗多糖溶液；将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶加入到果胶粗多糖溶液中酶解，酶解4-20 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用凝胶色谱柱和阴离子交换柱纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶在果胶粗多糖溶液中的终浓度均为0.5-1.5 U/mL。
6.如权利要求1所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解的方法为：将一级酶解多糖溶解于0.02-0.5 mol /L乙酸钠缓冲溶液中，配置成浓度为1-2.5 %（w/v）的一级酶解多糖溶液；向一级酶解多糖溶液中加入内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶，置于50℃条件下酶解1-2 h，得到二级酶解多糖，二级酶解多糖经真空浓缩除去75-85%的溶剂，冻干并研磨，得到低分子量HG型果胶，其中，内切多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶在一级酶解多糖溶液中的终浓度均为0.2-1.0U/mL。
7.如权利要求1所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，一级酶解多糖在进行二级定向酶解前先进行预处理，预处理的方法为：将一级酶解多糖采用截流分子量10kDa的超滤膜进行分级，然后再置于离心机中以8000-10000 r·min-1转速离心10-20 min，回收超滤渗余物，进行二级定向酶解。
8.如权利要求6所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，二级定向酶解采用超高压灭酶，灭酶的条件为：压力400-600 Mpa，温度40-65℃。
9.如权利要求1-8任一项所述的低分子量HG型果胶的构象表征，其特征在于，采用分光光度计测定果胶半乳糖醛酸含量、及果胶酯化羧基的含量，分析低分子量HG型果胶的酯化度；使用高效体积排阻色谱联合十八角度激光散射仪，以氯化钠为洗脱液测定低分子量HG型果胶的分子量及其分布；采用高效阴离子色谱仪，测定低分子量HG型果胶的中性糖组成和含量；采用傅立叶变换红外光谱仪分析低分子量HG型果胶中官能团类型；采用小角度X射线散射技术分析低分子量HG型果胶的空间构象参数；采用高场核磁共振仪分析的糖链化学结构；表征低分子量HG型果胶的空间构象。
10.如权利要求9所述的低分子量HG型果胶的构象表征，其特征在于，低分子量HG型果胶空间构象表征的方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.低分子量hg型果胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的低分子量hg型果胶的制备方法，其特征在于，果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻8-16 h，然后粉碎并过600-800 µm筛，再置于压力为0.37 mbar、温度为25-35℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
3.如权利要求1所述的低分子量hg型果胶的制备方法，其特征在于，采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/l的盐酸溶液调节ph至2-4，再升温至40-80℃并保温2-6 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1:30-50。
4.如权利要求2所述的低分子量hg型果胶的制备方法，其特征在于，分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为30-45%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为50-60%，静置12 h，再取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为65-80%，静置12 h，取沉淀物，将沉淀物装入截留分子量为3500 da的透析袋中并置于去离子水中，在24℃条件透析36-72 h，得到果胶粗多糖。
5.如权利要求1所述的低分子量hg型果胶的制备方法，其特征在于，采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：向果胶粗多糖中加入蒸馏水，配置成浓度为1-2.5 %（w/v）的果胶粗多糖溶液；将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-l-阿拉伯聚糖内切酶、β-d-半乳糖苷酶、β- (1→4)-d-半乳聚糖内切酶加入到果胶粗多糖溶液中酶解，酶解4-20 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用凝胶色谱柱和阴离子交换柱纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-l-阿拉伯聚糖内...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓燕，赵圆圆，王丹，常虹，郑鄢燕，赵文婷，王宇滨，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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