【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种tnnt2 h2b-mcherry报告细胞系的构建方法及应用。
技术介绍
1、tnnt2基因是心脏发育和分化中的重要调控基因，在心肌细胞中高度表达，而在其他细胞类型中表达极低或不表达。这使得tnnt2基因成为心肌细胞的标志性和特异性基因，可用于鉴定、分离和定位心肌细胞。tnnt2基因的异常表达或突变与多种心血管疾病的发生和发展相关，如心肌肥厚、心房纤颤和心肌病等。因此，tnnt2基因在心肌细胞肌纤维收缩调节、心肌细胞类型特异性表达以及心脏发育和心血管疾病研究中具有重要的功能和应用。
2、胚胎干细胞(embryonic stem cells，escs)是一类多能性干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，可以分化为包括神经元、心肌细胞、肌肉细胞等在内的三个胚层各种细胞类型。在体外，胚胎干细胞可以通过定向分化为特定细胞类型，如心肌细胞、神经细胞等，为组织工程提供不断的供应，并具有潜在治疗疾病的能力。目前，综合运用形态特征、细胞功能特征、细胞标志物、基因表达分析、免疫组化染色等方法，可以准确地鉴定和识别心肌细胞，并进一步进行心肌细胞的纯化和表征。但受主观性、疾病发展的动态性、个体间基因表达的差异性、染色的稳定性、抗体的特异性和灵敏性等的局限，无法实现心肌细胞的实时观察和研究。因此，亟需一种能够实时跟踪和可视化心肌细胞表达的有效平台，以更全面地了解和观察心肌细胞特异性基因表达，为心脏病理生理学和药物研发提供了新的工具和方法。
技术实现思路
1、本专
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种tnnt2 h2b-mcherry报告细胞系的构建方法，包括将h2b-mcherry敲入到tnnt2基因的5’端起始密码子的上游，筛选稳定表达荧光蛋白的tnnt2 h2b-mcherry报告细胞系的步骤。
4、优选的是，所述构建方法包括以下步骤：
5、构建靶向tnnt2基因的5’端起始密码子的sgrna的表达载体，以及含有荧光蛋白表达元件的重组载体；
6、将所述sgrna的表达载体和所述重组载体共转染干细胞，经培养、筛选，获取稳定表达荧光蛋白的tnnt2 h2b-mcherry报告细胞系。
7、优选的是，所述重组载体包括如下元件：
8、上游同源臂，其核苷酸序列如seq id no:1所示；
9、h2b-mcherry序列，其核苷酸序列如seq id no:2所示；
10、polya序列，其核苷酸序列如seq id no:3所示；
11、新霉素抗性-polya序列，其核苷酸序列如seq id no:4所示；以及
12、下游同源臂，其核苷酸序列如seq id no:5所示。
13、优选的是，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no：6所示。
14、优选的是，所述sgrna的表达载体和所述重组载体的质量比为1:2，所述培养的条件为37℃5％co2恒温培养，所述筛选为采用新霉素抗性筛选。
15、本专利技术还提供一种tnnt2 h2b-mcherry报告细胞系，利用所述的构建方法构建。
16、本专利技术还提供所述的tnnt2 h2b-mcherry报告细胞系在下述(1)-(6)任一项中的应用：
17、(1)在跟踪和可视化心肌细胞的发育过程中的应用；
18、(2)在心脏发育的分子机制的研究中的应用；
19、(3)在心血管疾病的发病机制的研究中的应用；
20、(4)在制备tnnt2基因相同位点荧光报告动物模型中的应用；
21、(5)在心血管疾病药物筛选中的应用；
22、(6)在制备心血管疾病治疗效果评估模型中的应用。
23、本专利技术公开了以下技术效果：
24、本专利技术利用crispr-cas9基因组编辑技术在小鼠胚胎干细胞r1中定点整合，将荧光蛋白基因敲入到tnnt2基因起始密码子上游，tnnt2和荧光蛋白通过h2b连接肽段形成融合蛋白，h2b的存在保证mcherry能够特异性在细胞核内表达，使其融合表达，筛选得到tnnt2h2b-mcherry报告细胞系，即形成了稳定表达荧光蛋白的细胞模型，通过荧光强度直接指示tnnt2基因的表达水平。本专利技术的tnnt2 h2b-mcherry报告细胞系可以实时观察和研究tnnt2基因的表达情况，用于跟踪和可视化心肌细胞的发育过程，研究心脏发育的分子机制、心血管疾病的发病机制、药物筛选和治疗效果评估，为心脏病理生理学和药物研发提供了新的工具和方法。
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1.一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的构建方法，其特征在于，包括将H2B-mCherry定点敲入到Tnnt2基因的5’端起始密码子的上游，筛选稳定表达荧光蛋白的Tnnt2H2B-mCherry报告细胞系的步骤。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体包括如下元件：
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的表达载体和所述重组载体的质量比为1:2，所述培养的条件为37℃5％CO2恒温培养，所述筛选为采用新霉素抗性筛选。
6.一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的构建方法构建。
7.如权利要求6所述的Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系在下述(1)-(6)任一项中的应用：
【技术特征摘要】
1.一种tnnt2 h2b-mcherry报告细胞系的构建方法，其特征在于，包括将h2b-mcherry定点敲入到tnnt2基因的5’端起始密码子的上游，筛选稳定表达荧光蛋白的tnnt2h2b-mcherry报告细胞系的步骤。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体包括如下元件：
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna的...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨藩，鲁国涛，刘丽娜，贺鑫，郭永超，薛画诗，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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