【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种构建col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源ⅲ型胶原蛋白的方法。
技术介绍
1、皮肤是人体最大的器官，它具有保护、感觉、分泌、排泄、呼吸等功能。它通过抵御外界微生物的入侵以及排泄体内废物，并起到维持机体内环境稳定的作用。健康皮肤的完整性在维持人体的生理动态平衡中起着至关重要的作用。当皮肤受到损伤后，糖尿病或压力性溃疡等许多原因可延迟伤口愈合，这使得皮肤最基本的保护屏障功能和表皮及其附属元件的功能发生丧失，进而发生内环境平衡紊乱和各种皮肤相关功能紊乱，给患者造成了严重的身心损害和经济负担。
2、皮肤的结构主要分为表皮和真皮两部分。表皮在真皮上方，为皮肤最外面的一层，表皮分为几个层，从靠近真皮往上分为基底层、棘层、颗粒层和角质层。创面愈合的本质是重建皮肤表皮基底层的角质形成细胞。这是因为，在表皮各类细胞当中，角质形成细胞数量占80％以上，且表皮基底层的角质形成细胞可以进行细胞增殖并向外层推移分化形成表皮的分层结构。角质形成细胞主导的皮肤表层重新分化过程是一个复杂而有序的生物学过程，需要细胞启动一系列基因表达和调控，在众多细胞因子和转录因子的参与下，包括物质和能量代谢、细胞外基质和骨架系统重建、信号转导和整合，呈现高度的有序性、整体性和网络协调性，实现细胞增殖、细胞迁移和粘连、分化，最终实现表皮的角质形成细胞与多层角质层的稳态结构重建。
3、ⅲ型胶原蛋白是一种主要的原纤维胶原，于1971年被miller等人首次发现。人体中编码ⅲ型胶原蛋白分子的基因位于二号染色体上，被称为col3
4、在组织弹性保持方面，ⅲ型胶原蛋白直径小于ⅰ型胶原蛋白，且具有更柔韧的结构(flexi-rod结构)，当两者同时存在于同一胶原纤维时，ⅲ型胶原蛋白能够通过与ⅰ型胶原蛋白的比例调节胶原直径。iii型胶原蛋白的缺失会致使皮肤弹性变差和血管形成受阻，导致ehlers-danlos综合征。iii型胶原蛋白的合成减少时，皮肤和心血管系统不能完成发育，皮肤基底层对真皮成纤维细胞施加的机械刺激也将会发生慢性减弱，导致成纤维细胞不能完全发挥功能，皮肤的张力，弹性和愈合能力下降。在伤口愈合过程中，交织的ⅰ型和ⅲ胶原纤维形成愈合伤口的结构支架，并促进细胞的粘附、趋化和迁移。凝血阶段，ⅲ型胶原蛋白与整合素和血小板相互作用，促进创面止血。修复阶段，ⅲ型胶原蛋白参与胶原蛋白沉积，构成纤维组织对创伤组织进行填补。瘢痕重塑阶段，当ⅲ型胶原蛋白含量较高，所形成的瘢痕组织较小，也更为接近正常皮肤；当ⅲ型胶原蛋白含量变少时，则会导致肌成纤维细胞的分化和更明显的伤口挛缩，伤口更难愈合。若将ⅲ型胶原蛋白应用于伤口敷料中，能够对伤口愈合起到促进作用。
5、因此，本专利技术使用crispr-cas9基因编辑技术构建基因组定点敲入col3a1基因的转基因斑马鱼品系，用斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白，为后续进一步研究奠定实验基础。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种构建col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白的方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种构建col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白的方法，其是利用crispr-cas9基因编辑技术，将人源col3a1基因敲入到斑马鱼的染色体上，构建col3a1转基因斑马鱼，用col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白；所述人源col3a1基因序列在ncbi中的gene id为1281。
4、上述一种构建col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白的方法中，所述col3a1转基因斑马鱼的构建包括以下步骤：
5、1)在斑马鱼基因组上选择高效的目标靶点；
6、2)设计和制备col3a1供体质粒；
7、3)sgrna和cas9 mrna的制备；
8、4)将col3a1供体质粒、sgrna和cas9 mrna显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵；
9、5)pcr筛选获得col3a1转基因斑马鱼品系。
10、上述一种构建col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白的方法中，所述col3a1转基因斑马鱼的构建具体包括以下方法：
11、1)在斑马鱼基因组上选择高效的目标靶点：在斑马鱼染色体上的非蛋白编码区，根据靶点预测和靶点的特异性的确认，选5’-acagctattctttacagtgtagg-3’作为靶标序列，称为pam1区；在靶标序列附近选取两边长度分别为134bp和156bp的序列作为同源性重组修复的同源臂，分别称为左臂5’arm和右臂3’arm；
12、2)设计和制备col3a1供体质粒：col3a1供体质粒包含原始骨架载体和插入序列，所述插入序列包括顺次连接的pam2区序列、左臂5’arm序列、cmv启动子序列、人源col3a1基因序列、polya信号序列、右臂3’arm序列及pam2区序列；
13、3)sgrna和cas9 mrna的制备：通过pcr扩增得到上游带有t7启动子的sgrna的双链dna1和双链dna2，用试剂盒进行体外转录得到sgrna1和sgrna2；通过pcr扩增得到上游带有sp6启动子且两侧带有核定位序列的cas9 dna序列，用试剂盒进行体外转录得到cas9mrna；
14、4)将col3a1供体质粒、sgrna和cas9 mrna显微注射到斑马鱼受精卵：按照col3a1供体质粒300ng/μl、cas9 mrna 100ng/μl、sgrna150ng/μl、sgrna250ng/μl的比例将其混合，显微注射到斑马鱼胚胎中；
15、5)pcr筛选获得col3a1转基因斑马鱼品系：将注射的斑马鱼胚胎养大至性成熟时，与野生型斑马鱼杂交，取其胚胎提取基因组作为模板，pcr扩增基因敲入位点，扩增的条带经测序验证正确性，筛选col3a1基因敲入成功的转基因斑马鱼；
16、步骤1)中所述左臂5’arm和右臂3’arm的核苷酸序列如下：
17、左臂5’arm：5’-gcccacatctccatttgagaggaatagaataaacagccataatatgaaatatagcaacag tgttgtttaagatcaacatttacggtcattgtgacttgtggggatgtttggtccacgcaatcacacacacacac-3’；
18、右臂3’arm：5’-gcacatgcacacacacactcacaatgcaaataaat本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建COL3A1转基因斑马鱼作为载体表达人源III型胶原蛋白的方法，其特征在于：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将人源COL3A1基因敲入到斑马鱼的染色体上，构建COL3A1转基因斑马鱼，用COL3A1转基因斑马鱼作为载体表达人源III型胶原蛋白；所述人源COL3A1基因序列在NCBI中的Gene ID为1281。
2.根据权利要求1所述的一种构建COL3A1转基因斑马鱼作为载体表达人源III型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述COL3A1转基因斑马鱼的构建包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种构建COL3A1转基因斑马鱼作为载体表达人源III型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述COL3A1转基因斑马鱼的构建具体包括以下方法：
4.根据权利要求3所述的一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源III型胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤1）中所述左臂5’arm和右臂3’arm的核苷酸序列如下：
5.根据权利要求3所述的一种构建COL3A1转基因斑马鱼作为载体表达人源III型胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤2）中所述P
6.根据权利要求3所述的一种构建COL3A1转基因斑马鱼作为载体表达人源III型胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤3）中所述sgRNA1序列如SEQ ID NO.11所示，所述sgRNA2序列如SEQ ID NO.11所示，所述Cas9 mRNA序列如SEQ ID NO.14所示。
7.如权利要求1所述的一种构建COL3A1转基因斑马鱼作为载体表达人源III型胶原蛋白的方法的应用，其特征在于：包括如下一种或多种：
...【技术特征摘要】
1.一种构建col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白的方法，其特征在于：利用crispr-cas9基因编辑技术，将人源col3a1基因敲入到斑马鱼的染色体上，构建col3a1转基因斑马鱼，用col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白；所述人源col3a1基因序列在ncbi中的gene id为1281。
2.根据权利要求1所述的一种构建col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述col3a1转基因斑马鱼的构建包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种构建col3a1转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述col3a1转基因斑马鱼的构建具体包括以下方法：
4.根据权利要求3所述的一种构建dgtm转基因斑马鱼作为载体表达人源iii型胶原蛋白的方法，其特征在于...
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