本发明专利技术公开了一种利什曼原虫等温扩增检测引物及检测方法，该方法通过设计与合成特异性等温扩增引物进行等温扩增过程，且扩增反应会产生副产物焦磷酸根，焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子会产生肉眼可见的白色沉淀，且可通过钙黄绿素与金属离子发生显色反应以观测结果，该方法相较与骨髓涂片镜检查减少了样本之间交叉污染，漏检率低，准确率高，该方法相较于PCR扩增检测成本更低，检测时间更短。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原体检测，更具体地，涉及一种利什曼原虫等温扩增检测引物及检测方法，可用于利什曼原虫病的早期诊断。
技术介绍
1、利什曼病是由利什曼原虫引起的人畜共患病，可引起人类皮肤及内脏黑热病。利什曼原虫寄生于人或动物巨噬细胞的一种寄生虫，通过白蛉叮咬传播内脏利什曼病或皮肤利什曼病等。目前，全球有超过10亿人口生活在利什曼病流行区并面临感染风险，每年约新增30000例内脏利什曼病病例和逾100万例皮肤利什曼病病例。20世纪末我国内脏利什曼病几近消除，但近年来部分地区又呈病例回升趋势。全球化的快速发展、人类经济活动及旅行范围的扩大，极大促进了感染性疾病在全球范围内的传播。
2、虽然重度利什曼原虫感染可致死，但大多数感染者可不出现任何症状，且利什曼原虫病具有3～5个月甚至更长潜伏期，携带低滴度水平虫体的无症状感染者难以被及时发现。内脏利什曼病的实验诊断依据为骨髓涂片镜检查见利什曼原虫无鞭毛体，易漏检，且无症状感染者依从度低。利什曼病常引起各种非特异性临床表现，难以确诊，使得该病防控十分困难。因此，迫切需要建立一种快速、准确、敏感、简便的利什曼原虫检测方法，用于快速筛查利什曼原虫，有助于利什曼原虫病流行病学调查和传播控制。
3、环介导等温扩增(lamp)是一种简单、快捷、特异性敏感性强的核酸扩增方法，且不需要贵重仪器，能肉眼观察结果，目前已经应用于多种病原体检测，lamp技术在正确判断利什曼原虫感染者方面具有更高准确性，lamp作为利什曼原虫病筛查方法，有助于利什曼原虫病流行病学调查和传播控制。
/>技术实现思路
1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术的目的是提供一种基于环介导等温扩增技术检测利什曼原虫引物，该检测方法能够快速、准确检测利什曼原虫，做到早诊断，早治疗，在病人骨髓穿刺前进行外周血lamp检测或者筛查，减少病入痛苦和负担，也可作利什曼原虫病流行病学调查及其传播风险监测。
2、为了实现本专利技术的目的，一方面，本专利技术提供一种利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，所述的利什曼原虫等温扩增检测引物包括：
3、正向内部引物为fip：
4、5’-ttgcgttcaaagattcggtaattgatatttcgttgaagaacgcagt-3’；
5、反向内部引物为bip：
6、5’-gcgcatgggagaagctctatttttttgttcgacactgagaa-3’；
7、正向外部引物为f3：5’-gtcgcgatggatgacttg-3’；
8、反向外部引物为b3：5’-atgcagaagagaggaggc-3’；
9、正向环引物lf：5’-gcaattgataccacttatcgcact-3’；
10、反向环引物lb：5’-atccccgtgcatgccata-3’。
11、进一步的，所述的正向内部引物fip和反向内部引物bip用于识别利什曼原虫特异性检测基因的靶序列。
12、进一步的，所述的正向外部引物f3和反向内部引物b3用于扩增利什曼原虫特异性检测基因的靶序列。
13、进一步的，所述的利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，所述的正向环引物lf和反向环引物lb用于提高扩增速度。
14、另一方面，本专利技术提供一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，所述的一种利什曼原虫等温扩增检测步骤包括：
15、s21、提取待测样品基因组dna为模板
16、s22、使用设计的引物进行lamp扩增反应
17、进一步的，所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，扩增反应体系包括：10×isothermal amplification buffer、mgso4、dntps、bst 2.0dna聚合酶、h2o。
18、进一步的所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，扩增反应体系还包括：所述的利什曼原虫等温扩增检测引物。
19、进一步的所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，扩增反应体系还包括：钙黄绿素指示剂，用于与镁离子结合。
20、进一步的所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，检测结果肉眼可见或可用浊度计检测。
21、进一步的所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，可查看反应液是否发生钙黄绿素与金属离子结合的显色反应以观测结果。
22、总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术骨髓涂片镜检查及pcr扩增检查相比，能够取得下列有益效果：
23、1.本专利技术简化了血样核酸提取方法比现有技术骨髓涂片镜检查减少了样本之间交叉污染，且现有技术骨髓涂片镜检查见利什曼原虫无鞭毛体，易漏检，且无症状感染者依从度低，容易造成假阴性，本专利技术具有准确率高、灵敏度高的特点。
24、2.本专利技术相比与pcr扩增检测利什曼原虫，成本更低，检测时间更短，pcr扩增检测利什曼原虫需要pcr仪、电泳系统及凝胶成像仪，成本昂贵，且pcr扩增过程时间久、制胶步骤繁琐，本专利技术扩增过程使用的仪器仅有水浴锅，成本低廉，且相较于pcr扩增检测利什曼原虫需要结果凝胶成像仪观测结果，本专利技术结果肉眼可见，使用更为简便，且lamp扩增方法现有技术多使用lamp试剂盒，更为方便运输使用。
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【技术保护点】
1.一种利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，所述的正向内部引物FIP和反向内部引物BIP用于识别利什曼原虫特异性检测基因的靶序列。
3.根据权利要求1所述的利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，所述的正向外部引物F3和反向内部引物B3用于扩增利什曼原虫特异性检测基因的靶序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，所述的正向环引物LF和反向环引物LB用于提高扩增速度。
5.一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的体系包括：10×Isothermal Amplification Buffer、MgSO4、dNTPs、Bst 2.0DNA聚合酶、H2O。
7.根据权利要求5所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的体系还包括：所述的利什曼原虫等温扩增检测引物。
<p>8.根据权利要求5-7中任一项所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的体系还包括：钙黄绿素指示剂，用于与镁离子结合。9.根据权利要求5-7中任一项所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，检测结果肉眼可见或可用浊度计检测。
10.根据权利要求5-7中任一项所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，还包括通过查看反应液是否发生钙黄绿素与金属离子结合的显色反应以观测结果。
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【技术特征摘要】
1.一种利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，所述的正向内部引物fip和反向内部引物bip用于识别利什曼原虫特异性检测基因的靶序列。
3.根据权利要求1所述的利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，所述的正向外部引物f3和反向内部引物b3用于扩增利什曼原虫特异性检测基因的靶序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的利什曼原虫等温扩增检测引物，其特征在于，所述的正向环引物lf和反向环引物lb用于提高扩增速度。
5.一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的一种利什曼原虫等温扩增检测方法，其特征在于，所述lamp扩增反应的体系包括：10×isothe...
【专利技术属性】
技术研发人员：周水茂，贾西帅，袁晴川，罗华堂，杨燕，陈芳，徐文秀，
申请(专利权)人：武汉市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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