【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用转运工程策略改造酿酒酵母工程菌提高麦角硫因产量的方法，属于生物工程。
技术介绍
1、麦角硫因(l-ergothioneine，egt)，学名2-巯基-l-组氨酸三甲基内盐，是1909年tanret等人在研究麦角真菌clavicepspurpurea时分离出的一种独特含硫化合物，是一种稀有的天然氨基酸衍生物。在生理ph条件下，麦角硫因主要以硫酮的形式存在，因其具有较高的氧化还原电势，不易发生自身氧化，所以具有比其他硫醇类抗氧化剂(如谷胱甘肽)更高的稳定性和更强的抗氧化活性。麦角硫因具有清除自由基、维持细胞正常生长、维持dma生物合成、防止紫外线辐射引起的损伤、美白、抗衰老、抗炎等诸多功能，在抗氧化和调节能量方面发挥着重要作用，是一种多功能的细胞生理保护剂。麦角硫因独特的生理功能及理化性质，决定了它在化妆品、食品、生物医学等领域具有广阔的应用前景。
2、目前，国内外获取麦角硫因的方法主要有三种，分别是提取法、化学合成法、微生物发酵法。其中，从食用菌中提取麦角硫因存在耗时、提取效率低、杂质多等问题，从而限制了麦角硫因的产业化。而化学合成法无法保证其安全性，原料成本高昂。微生物发酵法具有原料易获取、生产成本低、产能易扩大等优点，是麦角硫因产业化的发展方向。但是目前，化学合成法占据大部分市场，导致其价格居高不下，未来麦角硫因价格也将处于较高水平，这严重限制了麦角硫因的多方面应用。所以，利用更经济更高效的方法生产麦角硫因，是麦角硫因合成及发展的重要研究方向。
3、微生物制造的产品，从天然产品、聚
4、在本研究利用转运工程策略对麦角硫因生产菌进行改造，以达到提高麦角硫因产量的目的，进而推进麦角硫因在更多领域的应用，满足多方面的市场需求。
技术实现思路
1、利用微生物细胞工厂生产天然化合物时，胞内产物浓度过高会引发反馈抑制并产生一定的细胞毒性，降低上游途径代谢酶的催化活性，进而限制目标代谢物的发酵产量。为解决上述问题，本专利技术基于转运工程策略来促进胞内产物的外排，提高生物合成途径通量，以实现目标代谢产物的高效生产。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术首要目的是，请求保护参与麦角硫因外排转运的相关蛋白编码基因及其在提高麦角硫因产量中的应用，涉及的基因mrh1、phm7、hnm1、tpo5和scw10依次具有如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5所示序列。
4、本专利技术的一种实施方式中，所述mrh1、phm7、hnm1、tpo5和scw10的核苷酸序列的genebank号依次为：851597、854070、852803、853680、855352。
5、本专利技术提供了一种基于转运工程策略提高麦角硫因发酵产量的方法，所述提高麦角硫因发酵产量的方法是通过基因工程手段构建过表达相关基因的酿酒酵母工程菌；所述相关基因为mrh1、phm7、hnm1、tpo5和scw10。
6、具体地，所述过表达基因mrh1、phm7、hnm1、tpo5或scw10的酿酒酵母工程菌按下述方法构建：
7、(1)以酿酒酵母saccharomyces cerevisiae s288c基因组为模板，扩增mrh1、phm7、hnm1、tpo5或scw10基因序列，或者参考上述基因编码蛋白进行密码子优化获得基因序列。
8、(2)将游离表达载体酶切后，胶回收后获得线性化载体片段。
9、(3)将线性化游离表达载体分别与目的基因mrh1、phm7、hnm1、tpo5或scw10进行无缝克隆连接后转入大肠杆菌escherichia coli dh5α感受态细胞，经筛选验证后，得到分别含有过表达基因的重组载体；
10、(4)将上述构建的重组表达载体分别转入s.cerevisiae by4741菌株，经s c-ura固体培养筛选，获得分别含有过表达目的基因的重组载体的酿酒酵母转化子；
11、(5)将上述初步筛选得到的酿酒酵母转化子进行菌液pcr、测序验证正确后，获得转化成功的酿酒酵母工程菌m02-mrh1、m02-phm7、m02-hnm1、m02-tpo5或m02-scw10；
12、(6)利用工程菌进行液体发酵并取样，经hplc检测发酵液中麦角硫因含量，经多次传代培养并经过液体发酵验证，最终获得高产麦角硫因且稳定遗传的酿酒酵母重组菌株。
13、进一步，步骤(1)中，所述基因mrh1、phm7、hnm1、tpo5或scw10可采用普通pcr或巢氏pcr克隆获得。
14、进一步，步骤(2)所述线性化游离表达载体为pyes2-ura3-egt1-egt2，其中包含自主复制序列、氨苄青霉素抗性基因(ampr)表达框、ura3基因表达框、egt1&2基因(麦角硫因合成关键基因egt1和egt2)表达框、启动子序列、终止子序列。
15、进一步，步骤(4)所述sc-ura筛选培养基组分为：sc-ura粉末8g，葡萄糖20g，加去离子水定容至1l，121℃高温高压湿热灭菌20min，室温保存。固体培养基需加入2～3％琼脂粉。
16、进一步，步骤(5)所述重组表达载体分别pyes2-ura3-egt1-egt2-mrh1、pyes2-ura3-egt1-egt2-phm7、pyes2-ura3-egt1-egt2-hnm1、pyes2-ur a3-egt1-egt2-tpo5或pyes2-ura3-egt1-egt2-scw10。
17、进一步，步骤(6)所述液体发酵培养基组分为(1l)：ynb(含硫酸铵)6.7g、d-葡萄糖20～30g、l-精氨酸0.2-0.5g、l-半胱氨酸0.05-0.07g、l-赖氨酸0.05-0.1g、l-苏氨酸0.05-0.1g、l-天冬氨酸0.1-0.3g、l-异亮氨酸0.2-0.4g、l-苯丙氨酸0.02-0.05g、l-脯氨酸0.05-0.1g、l-丝氨酸0.2-0.4g、l-酪氨酸0.01-0.05g、l-缬氨酸0.02-0.05g、l-甲硫氨酸0.2-0.5g、l-色氨酸0.2-0.5g、l-组氨酸0.2-0.5g、l-亮氨酸0.1-0.3g、腺嘌呤0.05-0.1g、l-谷氨酸0.02-0.04g、l-谷氨酰胺0.02-0.04g、l-甘氨酸0.1-0.2g、l-丙氨酸0.0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.过表达外排转运蛋白编码基因在提高麦角硫因发酵生产中的应用，其特征在于，将下述基因或蛋白序列相似度高的外排转运蛋白在其他生物体中的表达用于麦角硫因的生产；
2.一种过表达关键基因强化麦角硫因外排转运提高麦角硫因发酵产量的方法，其特征在于，通过基因工程技术将目的基因MRH1、PHM7、HNM1、TPO5或SCW10分别导入产麦角硫因的酿酒酵母工程菌中，构建酿酒酵母工程菌株M02-MRH1、M02-PHM7、M02-HNM1、M02-TPO5或M02-SCW10。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，运用LiAc/ssDNA/PEG高效转化或电转化将过表达基因MRH1/PHM7/HNM1/TPO5/SCW10的重组载体导入酿酒酵母中，构建酿酒酵母工程菌。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，构建流程如下：将目的基因MRH1/PHM7/HNM1/TPO5/SCW10与线性化载体pYES2-URA3-EGT1-EGT2连接，得到重组载体pYES2-URA3-EGT1-EGT2-MRH1/PHM7/HNM1/TPO5/SCW10；用所述重组
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，线性化载体为游离型表达载体pYES2-URA3-EGT1-EGT2，其中包含氨苄青霉素抗性基因表达框、URA3基因表达框、EGT1&2基因表达框、酵母启动子、酵母终止子。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，酿酒酵母工程菌株是在合成培养基中进行液体发酵积累麦角硫因，所述液体发酵培养基组分为(1L)：YNB 6.7g、D-葡萄糖20～30g、L-精氨酸0.2-0.5g、L-半胱氨酸0.05-0.07g、L-赖氨酸0.05-0.1g、L-苏氨酸0.05-0.1g、L-天冬氨酸0.1-0.3g、L-异亮氨酸0.2-0.4g、L-苯丙氨酸0.02-0.05g、L-脯氨酸0.05-0.1g、L-丝氨酸0.2-0.4g、L-酪氨酸0.01-0.05g、L-缬氨酸0.02-0.05g、L-甲硫氨酸0.2-0.5g、L-色氨酸0.2-0.5g、L-组氨酸0.2-0.5g、L-亮氨酸0.1-0.3g、腺嘌呤0.05-0.1g、L-谷氨酸0.02-0.04g、L-谷氨酰胺0.02-0.04g、L-甘氨酸0.1-0.2g、L-丙氨酸0.01-0.05g、L-天冬酰胺0.05-0.08g、硫酸铵5-10g、硫酸铜0.1-0.16mg、盐酸吡哆醇1.0-1.6mg、生物素0.25-0.5mg、硫酸亚铁0.025-0.05mg。
...【技术特征摘要】
1.过表达外排转运蛋白编码基因在提高麦角硫因发酵生产中的应用，其特征在于，将下述基因或蛋白序列相似度高的外排转运蛋白在其他生物体中的表达用于麦角硫因的生产；
2.一种过表达关键基因强化麦角硫因外排转运提高麦角硫因发酵产量的方法，其特征在于，通过基因工程技术将目的基因mrh1、phm7、hnm1、tpo5或scw10分别导入产麦角硫因的酿酒酵母工程菌中，构建酿酒酵母工程菌株m02-mrh1、m02-phm7、m02-hnm1、m02-tpo5或m02-scw10。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，运用liac/ssdna/peg高效转化或电转化将过表达基因mrh1/phm7/hnm1/tpo5/scw10的重组载体导入酿酒酵母中，构建酿酒酵母工程菌。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，构建流程如下：将目的基因mrh1/phm7/hnm1/tpo5/scw10与线性化载体pyes2-ura3-egt1-egt2连接，得到重组载体pyes2-ura3-egt1-egt2-mrh1/phm7/hnm1/tpo5/scw10；用所述重组载体转化产麦角硫因的酿酒酵母，通过sc-ura固体培养筛选，获得含重组载体pyes2-ura3-egt1-egt2-mrh1/phm7/hnm1/tpo5/scw10的酿酒酵母工程菌株。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：王亮，程婧妍，郭越，陈喜媚，李倩，聂钒宇，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：
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