【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，特别是涉及一种生产角鲨烯的酵母工程菌及其应用。
技术介绍
1、角鲨烯(squalene)是一种重要的多不饱和三萜，广泛应用于食品、化妆品、制药等行业。角鲨烯作为一种开环三萜类化合物，是合成各种不饱和三萜类和甾体的关键前体。角鲨烯因其有着多个共轭不饱和双键而具有优异的抗氧化性能，可用于治疗湿疹和制作抗衰老抗皱化妆品。角鲨烯除了具有良好的抗氧化性能外，还具有良好的抗心血管和抗癌活性。此外，角鲨烯可以通过刺激生物体先天的免疫细胞，促进组织修复和伤口愈合，还可以降低脂肪酸含量，从而降低血糖和血脂。因其稳定性强、生物相容性好，目前被用于许多疫苗和药物输送乳剂。
2、目前角鲨烯主要的来源是从深海鲨鱼的肝脏中进行提取，这一提取方式导致了大量鲨鱼的捕杀，生态平衡的破坏。角鲨烯的另一种获取方法是从植物及其加工的副产物中提取，虽部分解决了原料来源问题，但也存在种植面积小、不易收集、周期长等不足。所以，基于满足未来市场对角鲨烯的巨大需求以及对野生海洋动物和自然环境的保护，迫切需要发展一种经济、绿色、节约的角鲨烯制造方法，来填补巨大的市场缺口，造福人类健康。
3、随着合成生物技术及代谢工程的发展，构建微生物细胞工厂高效合成天然产物已经成为一种有效的绿色生产方式。酵母(saccharomyces)为单细胞真菌，是一类集遗传背景清晰、发酵周期短和生物安全性高等多种优势于一体的重要模式生物，因此，通过在酵母中优化角鲨烯生物合成途径，获得高产角鲨烯的微生物细胞工程，是实现角鲨烯高效、绿色、安全生产的重要途径之一。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种生产角鲨烯的酵母工程菌及其应用，优化角鲨烯生物合成途径，构建微生物细胞工厂，实现角鲨烯高效、绿色、安全的生产。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
3、一方面，本专利技术提供了一种生产角鲨烯的酵母工程菌，包括酵母底盘细胞、异源角鲨烯生物合成模块、nadph供应模块、前体供应模块和油脂体工程模块；其中，
4、所述异源角鲨烯生物合成模块包括schmg1基因和erg9基因；所述nadph供应模块包括g6pd基因和pgd基因；所述前体供应模块包括atipk基因和lhchk基因；所述油脂体工程模块包括dga1基因。
5、优选的，在上述酵母工程菌中，所述g6pd基因的编码为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；所述pgd基因的编码为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；所述atipk基因的编码为异戊烯基磷酸激酶；所述lhchk基因的编码为胆碱激酶；所述dga1基因的编码为二酰基甘油酰基转移酶。
6、优选的，在上述酵母工程菌中，所述酵母底盘细胞为解脂耶氏酵母和酿酒酵母中的任意一种。
7、优选的，在上述酵母工程菌中，所述schmg1基因的核苷酸序列为与genbank登录号为nc_001145所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的核苷酸序列；所述erg9基因的核苷酸序列为与genbank登录号为af092497所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的核苷酸序列；所述g6pd基因的核苷酸序列为与genbank登录号为xp_504275所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的核苷酸序列；所述pgd基因的核苷酸序列为与genbank登录号为nc_006068所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的核苷酸序列；所述atipk基因的核苷酸序列为与genbank登录号为nc_003070所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的核苷酸序列；所述lhchk基因的核苷酸序列为与genbank登录号为aacy01730427所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的核苷酸序列；所述dga1基因的核苷酸序列为与genbank登录号为nc_006071所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的核苷酸序列。
8、优选的，在上述酵母工程菌中，所述schmg1基因编码蛋白质的氨基酸序列为与genbank登录号为np_013573所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的氨基酸序列；所述erg9基因编码蛋白质的氨基酸序列为与genbank登录号为aad22408.1所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的氨基酸序列；所述g6pd基因编码蛋白质的氨基酸序列为与genbank登录号为xp_504275.1所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的氨基酸序列；所述pgd基因编码蛋白质的氨基酸序列为与genbank登录号为xp_500938.1所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的氨基酸序列；所述atipk基因编码蛋白质的氨基酸序列为与genbank登录号为np_173986.2所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的氨基酸序列；所述lhchk基因编码蛋白质的氨基酸序列为与genbank登录号为eab58943.1所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的氨基酸序列；所述dga1基因编码蛋白质的氨基酸序列为与genbank登录号为xp_504700.1所示序列相同或同源性大于80％且对角鲨烯合成具有同等功能的氨基酸序列。
9、优选的，在上述酵母工程菌中，所述schmg1基因的genbank登录号为nc_001145；所述erg9基因的genbank登录号为af092497；所述g6pd基因的genbank登录号为xp_504275；所述pgd基因的genbank登录号为nc_006068；所述atipk基因的genbank登录号为nc_003070；所述lhchk基因的genbank登录号为aacy01730427；所述dga1基因的genbank登录号为nc_006071。
10、另一方面，本专利技术提供了一种上述酵母工程菌生产角鲨烯的方法，包括以下步骤：
11、s1：将异源角鲨烯生物合成模块中的关键酶编码基因整合至酵母底盘细胞内，得到包含有角鲨烯生物合成途径的酵母基因组；
12、s2：将nadph供应模块、前体供应模块及油脂体工程模块整合至s1中的酵母基因组中，得到生产角鲨烯的酵母工程菌；
13、s3：将s2中的酵母工程菌以yyg培养基为底物进行发酵65-78h，得到角鲨烯。
14、优选的，在上述酵母工程菌生产角鲨烯的方法中，还包括多拷贝整合位点上游同源臂rdna up、多拷贝整合位点下游同源臂rdnadown、启动子tefp和fbap、终止子xpr2t和lip2t以及筛选标记ura3和leu2。
15、优选的，在上述酵母工程菌生产角鲨烯的方法中，步骤s3中所述yyg培养基为yyg-60培养基，所述yyg培养基中含有8-10g/l酵母提取物、7-9g/l不含氨基酸的酵母氮源和50-60g/l葡萄糖。
16、优选的，在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产角鲨烯的酵母工程菌，其特征在于，包括酵母底盘细胞、异源角鲨烯生物合成模块、NADPH供应模块、前体供应模块和油脂体工程模块；
2.根据权利要求1所述的生产角鲨烯的酵母工程菌，其特征在于，所述G6PD基因的编码为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；所述PGD基因的编码为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；所述AtIPK基因的编码为异戊烯基磷酸激酶；所述LhCHK基因的编码为胆碱激酶；所述DGA1基因的编码为二酰基甘油酰基转移酶。
3.根据权利要求1所述的生产角鲨烯的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母底盘细胞为解脂耶氏酵母和酿酒酵母中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的生产角鲨烯的酵母工程菌生产角鲨烯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的酵母工程菌生产角鲨烯的方法，其特征在于，还包括多拷贝整合位点上游同源臂rDNAup、多拷贝整合位点下游同源臂rDNAdown、启动子TEFp和FBAp、终止子XPR2t和LIP2t以及筛选标记URA3和LEU2。
6.根据权利要求4所述的酵母工程菌生产角鲨烯的方法，其特征在于，步骤
7.根据权利要求4所述的酵母工程菌生产角鲨烯的方法，其特征在于，步骤S3中角鲨烯的产量为1600mg/L以上。
8.一种权利要求1-3任一项所述的生产角鲨烯的酵母工程菌或权利要求4-7任一项所述的酵母工程菌生产角鲨烯的方法在制备角鲨烯生产制剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种生产角鲨烯的酵母工程菌，其特征在于，包括酵母底盘细胞、异源角鲨烯生物合成模块、nadph供应模块、前体供应模块和油脂体工程模块；
2.根据权利要求1所述的生产角鲨烯的酵母工程菌，其特征在于，所述g6pd基因的编码为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；所述pgd基因的编码为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；所述atipk基因的编码为异戊烯基磷酸激酶；所述lhchk基因的编码为胆碱激酶；所述dga1基因的编码为二酰基甘油酰基转移酶。
3.根据权利要求1所述的生产角鲨烯的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母底盘细胞为解脂耶氏酵母和酿酒酵母中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的生产角鲨烯的酵母工程菌生产角鲨烯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的酵母工程菌生...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘虎虎，刘紫莹，黄明康，唐茂程，田云，卢向阳，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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