【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改进quechers结合酶联免疫吸附法快速检测谷物中的赭曲霉毒素a的方法，属于食品安全检测。
技术介绍
1、据粮食及农业组织报告，每年超过25％的粮食作物会受到真菌毒素的污染。赭曲霉毒素a是污染谷物及谷物产品的主要真菌毒素，容易在种植、加工、运输和储藏过程中产生。赭曲霉毒素a是曲霉菌和青霉菌产生的有毒的次生代谢物，具有肾毒性、免疫毒性、神经毒性、致畸性和致癌性(2b类)。而且，赭曲霉毒素a具有较高的热稳定性和脂溶性，被污染的谷物及谷物产品中的赭曲霉毒素a被高温高压处理3小时也不能完全去除，易在人体中积累对人体健康造成潜在威胁。因此，谷物中赭曲霉毒素a的风险分析非常重要。
2、quechers是一种前处理技术，具有良好的通用性和灵活性，可用于提取多种化合物。与其他方法相比，quechers样品制备首先使用乙腈和盐的混合物萃取目标物质，然后使用吸附剂清除杂质。然而，作为传统的萃取剂，乙腈对细胞具有高毒性，不符合“绿色化学”原则，易对人体和环境造成危害。此外，需要尝试使用不同的材料开发绿色吸附剂，代替价格昂贵的n-丙基乙二胺、石墨化碳黑和十八烷基键合硅胶去改进quechers的净化效率，使其应用在复杂农业和食品样品中有害物质的残留分析。因而，迫切需要开发新型绿色环保、低成本的提取剂和吸附剂提升萃取效率和净化效率。
3、酶联免疫吸附法作为一种筛选技术被应用于有害物质的测定，具有操作简单、灵敏度高、可同时处理多个样品、易于标准化的特点。然而，传统elisa的孵育和清洗过程耗时长，需要将抗原和抗体等
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种改进quechers结合酶联免疫吸附法快速检测谷物中的赭曲霉毒素a的方法。
3、(二)技术方案
4、为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括:
5、一种改进quechers结合酶联免疫吸附法快速检测谷物中的赭曲霉毒素a的方法，其包括如下步骤:
6、s1、在谷物样品中添加制备好的天然低共熔溶剂水溶液，涡旋混匀后抽取液体得到萃取溶液；
7、s2、取萃取溶液加入吸附剂，涡旋后通过过滤获得去除杂质后的萃取液；
8、s3、将辣根过氧化物酶和赭曲霉毒素a的单克隆抗体包被的金纳米颗粒偶联物、赭曲霉毒素a抗原偶联的磁纳米颗粒探针、萃取液和碳酸氢钠溶液充分泡腾后，采用磁力架，并用洗涤缓冲液洗涤三次，然后加入单组分3，3'，5，5'-四甲基联苯胺过氧化物酶底物液反应，最后加入盐酸终止反应，将显色溶液移入96孔板中，并在450nm处记录吸光度；
9、s4、制备赭曲霉毒素a的标准品，按步骤s3进行检测，以标准品的浓度为横坐标、相应的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，得出赭曲霉毒素a线性方程；
10、s5、将获得的待测样品的吸光度代入赭曲霉毒素a线性方程中，即获得到待测样品中赭曲霉毒素a的残留浓度。
11、如上所述的方法，优选地，在步骤s1中，所述天然低共熔溶剂为葡萄糖与乙酰丙酸、甘露糖与乙酰丙酸或木糖与乙酰丙酸在100℃水浴中，形成澄清透明液体，再与水混合后的溶液为萃取剂；其中，葡萄糖与乙酰丙酸、甘露糖与乙酰丙酸或木糖与乙酰丙酸混合比例按摩尔比1:1～1:6。
12、进一步地，所述萃取剂优选为按摩尔比1:4的葡萄糖与乙酰丙酸的天然低共熔溶剂再与水混匀，天然低共熔溶剂占60～90％。
13、如上所述的方法，优选地，在步骤s1中，谷物样品为0.5～2g，所述中萃取剂的体积是0.75～2ml，所述涡旋时间为0.5～2min。
14、进一步地，优先谷物样品为1g，所述萃取剂的体积是1.25ml。
15、如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，所述吸附剂为n-丙基乙二胺、石墨化碳黑、十八烷基键合硅胶、木质素磺酸钠或碱性木质素中的任一种。
16、如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，取萃取溶液与吸附剂按1:10单位为ml:mg的比例进行混合，所述过滤为通过孔径为0.45μm的滤膜。
17、如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，所述吸附剂的用量是0.5～10mg。
18、进一步地，最优地吸附剂为碱性木质素，最优用量为2mg。
19、如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，所述辣根过氧化物酶和赭曲霉毒素a的单克隆抗体包被的金纳米颗粒偶联物为按金纳米颗粒、赭曲霉毒素a的单克隆抗体、辣根过氧化物酶按1ml:0.0001mg:0.000005mg～0.0001mg的比例混合并在碳酸钾溶液中进行孵育反应获得；
20、所述赭曲霉毒素a抗原偶联的磁纳米颗粒探针为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、赭曲霉毒素a抗原与磁纳米颗粒按1:1:0.5:5的比例混合制得。
21、如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，赭曲霉毒素a抗原偶联的磁纳米颗粒探针的浓度0.06～0.2mg ml-1，时；金纳米颗粒偶联物:磁纳米颗粒探针:萃取液:碳酸氢钠溶液按体积比1:1:1:2进行混合，碳酸氢钠溶液的反应体积为50～300μl。
22、如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，所述单组分3，3'，5，5'-四甲基联苯胺过氧化物酶底物液的反应条件为37℃下培养10min。
23、如上所述的方法，优选地，在步骤s4中，所述赭曲霉毒素a的标准品的浓度为3、5、10、25、50和100μg kg-1。
24、一种用于快速检测谷物中的赭曲霉毒素a的试剂盒，其包括低共熔溶剂、辣根过氧化物酶和赭曲霉毒素a的单克隆抗体包被的金纳米颗粒偶联物、赭曲霉毒素a抗原偶联的磁纳米颗粒探针、碳酸氢钠溶液、碱性木质素和单组分3，3'，5，5'-四甲基联苯胺过氧化物酶底物液。
25、其中，低共熔溶剂为按摩尔比1:4的葡萄糖与乙酰丙酸混合物占70％的水溶液，辣根过氧化物酶和赭曲霉毒素a的单克隆抗体包被的金纳米颗粒偶联物为按金纳米颗粒、赭曲霉毒素a的单克隆抗体、辣根过氧化物酶按1ml:0.000005mg～0.0001mg:0.0001mg的比例混合并在碳酸钾溶液中进行孵育反应获得；
26、赭曲霉毒素a抗原偶联的磁纳米颗粒探针的浓度为0.06mg ml-1，碳酸氢钠溶液的浓度为2m。
27、(三)有益效果
28、本专利技术的有益效果是:
29、本专利技术提供的改进quechers结合酶联免疫吸附法快速检测谷物中的赭曲霉毒素a的方法，是基于天然低共熔溶剂和吸附剂的quechers结合金纳米颗粒和磁珠酶联免疫吸附法对谷物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种改进QuEChERS结合酶联免疫吸附法快速检测谷物中的赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，其包括如下步骤:
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述天然低共熔溶剂为葡萄糖与乙酰丙酸、甘露糖与乙酰丙酸或木糖与乙酰丙酸在100℃水浴中，形成澄清透明液体，再与水混合后的溶液为萃取剂；其中，葡萄糖与乙酰丙酸、甘露糖与乙酰丙酸或木糖与乙酰丙酸混合比例按摩尔比1:1～1:6。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，谷物样品为0.5～2g，所述中天然低共熔溶剂的体积是0.75～2mL，所述涡旋时间为0.5～2min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述吸附剂为N-丙基乙二胺、石墨化碳黑、十八烷基键合硅胶、木质素磺酸钠或碱性木质素中的任一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，取萃取溶液与吸附剂按1:10单位为mL:mg的比例进行混合，所述吸附剂的用量是0.5～10mg；
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述辣根过氧化物酶和赭曲霉毒素
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，赭曲霉毒素A抗原偶联的磁纳米颗粒探针的浓度0.06～0.2mg mL-1，时；金纳米颗粒偶联物:磁纳米颗粒探针:萃取液:碳酸氢钠溶液按体积比1:1:1:2进行混合，碳酸氢钠溶液的反应体积为50～300μL。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述单组分3，3'，5，5'-四甲基联苯胺过氧化物酶底物液的反应条件为37℃下培养10min。
9.一种用于快速检测谷物中的赭曲霉毒素A的试剂盒，其特征在于，其包括低共熔溶剂、辣根过氧化物酶和赭曲霉毒素A的单克隆抗体包被的金纳米颗粒偶联物、赭曲霉毒素A抗原偶联的磁纳米颗粒探针、碳酸氢钠溶液、碱性木质素和单组分3，3'，5，5'-四甲基联苯胺过氧化物酶底物液。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，低共熔溶剂为按摩尔比1:4的葡萄糖与乙酰丙酸混合物占70％的水溶液，辣根过氧化物酶和赭曲霉毒素A的单克隆抗体包被的金纳米颗粒偶联物为按金纳米颗粒、赭曲霉毒素A的单克隆抗体、辣根过氧化物酶按1mL:0.0001mg:0.000005mg～0.0001mg的比例混合并在碳酸钾溶液中进行孵育反应获得；
...【技术特征摘要】
1.一种改进quechers结合酶联免疫吸附法快速检测谷物中的赭曲霉毒素a的方法，其特征在于，其包括如下步骤:
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s1中，所述天然低共熔溶剂为葡萄糖与乙酰丙酸、甘露糖与乙酰丙酸或木糖与乙酰丙酸在100℃水浴中，形成澄清透明液体，再与水混合后的溶液为萃取剂；其中，葡萄糖与乙酰丙酸、甘露糖与乙酰丙酸或木糖与乙酰丙酸混合比例按摩尔比1:1～1:6。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s1中，谷物样品为0.5～2g，所述中天然低共熔溶剂的体积是0.75～2ml，所述涡旋时间为0.5～2min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s2中，所述吸附剂为n-丙基乙二胺、石墨化碳黑、十八烷基键合硅胶、木质素磺酸钠或碱性木质素中的任一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s2中，取萃取溶液与吸附剂按1:10单位为ml:mg的比例进行混合，所述吸附剂的用量是0.5～10mg；
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述辣根过氧化物酶和赭曲霉毒素a的单克隆抗体包被的金纳米颗粒偶联物为按金纳米颗粒、赭曲霉毒素a的单克隆抗体、辣根过氧化物酶按1ml:0.0001mg:0.000005m...
【专利技术属性】
技术研发人员：荆旭，刘瑾，赵璐瑶，张雅雯，岳雅洁，王敏，王晓闻，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。