【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医用分离诊断及治疗领域，涉及微生物检测、微生物分离培养及药物筛选系统，尤其涉及一种快速分离检测结核分枝杆菌的方法，具体用于结核病菌的检测、结核病菌分离培养及后续药物耐药性筛选。
技术介绍
1、结核病(tuberculosis，tb)是一种严重危害人类健康的慢性、致死性传染病，主要是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)感染所致。结核病仍是who列出的全球十大死因之一，患者遍及全球各国及不同年龄；总体而言，90％为成年患者(≥15岁)。据who统计，中国结核病患者占全球的8.5％，患病人数居世界第二位(2021年who统计数据)，是中国重点控制的重大疾病之一。
2、结核病的主要传播途径包括呼吸道传染、消化道传染、母婴传染。在结核病患者中，大多数患者首次感染结核分枝杆菌时症状非常轻微，潜伏性结核感染者通常不会出现症状。而活动性结核病的症状包括连续咳嗽并伴有黏稠浓痰或血痰、疲乏及体重减轻等。活动性肺结核病的症状可在数周或数月内逐渐出现。尽管临床上已采用多种药物联用的方式治疗结核病，但由于耐多药(multidrug-resistant，mdr)菌株、泛耐药(extensively drug-resistant，xdr)菌株和全耐药(totally drug-resistance，tdr)菌株大量出现，结核病的防治仍存在较大的问题。特别是mdr和xdr导致的结核病仍是我国结核病疫情消灭的主要障碍。结核病常用的检测和诊断方法有：胸片、ct等影像学检查；痰涂片抗酸梁色查抗酸杆菌；痰培养
3、常用的检测方法如胸片、ct等影像学检查方法对早期感染患者无效，对已经感染结核分枝杆菌且肺部产生病灶的患者，该检查有效，特别使用于肺结核病的治疗检查，过度使用对身体有不良影响。
4、痰培养找结核杆菌的检查方法，痰培养周期比较长，一般情况需要七天时间，只有在开放性肺结核患者的痰液中才有可能培养出结核分枝杆菌菌株，且容易受杂菌污染。
5、ppd实验是指通过皮内注射结核菌素，并根据注射部位的皮肤状况诊断结核分枝杆菌感染所致ⅳ型超敏反应的皮内试验。此检查不能单独作为是否感染的诊断标准，对某些确定感染但免疫反应较低的患者，易出现假阴性。因此该检查只能作为诊断参考，不能作为独立诊断标准。
6、t-spot.tb检测利用结核特异抗原esat-6及cfp-10，通过酶联免疫斑点技术elispot检测受试者体内是否存在结核效应t淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌(现症感染)。
7、综上所述，现有的结核病检测方法各有优缺点，没有解决结核分枝杆菌的快速检测、分离，以便为分枝杆菌快速培养、鉴定和药物敏感性检测提供可靠的样本。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速分离检测结核分枝杆菌的方法，为结核分枝杆菌的培养、鉴定和药物敏感性检测及临床治疗提供依据。
2、本专利技术的目的是这样实现的：
3、利用结核分枝杆菌噬菌体中的肽段pk34基因与大肠杆菌外膜蛋白ompc基因相融合，借助his-tag蛋白纯化磁珠(ida-ni)建立能够在大肠杆菌表面对结核分枝杆菌噬菌体pk34及组氨酸标签进行重组表达的蛋白融合体，通过大肠杆菌表面表达的pk34与分枝杆菌表面索因子(tdm)进行有效结合，从样品中对结核分枝杆菌进行分离，为样本中结核分枝杆菌的分离与筛选提供新方法。
4、具体地说，本方法包括下列步骤：
5、①利用大肠杆菌最丰富的外膜蛋白ompc结构中的穿膜特性，构建ompc基因与结核分枝杆菌噬菌体小分子多肽pk34基因的融合载体，同时搭载his-tag标签，借助ompc表面识别和表面定位功能将pk34肽段、his-tag标签携带并定位于大肠杆菌细胞表面；
6、②通过将重组菌株固定于镍元素包被磁珠(ida-ni)后，与含有结核分枝杆菌的样品充分混合，用生理盐水洗涤，除去未结合菌体，以便从样品中通过pk34钓取结核分枝杆菌；
7、③最后使用咪唑缓冲液洗涤磁珠，将洗脱液在含甲氧苄啶(tmp)的培养基中进行培养，最终得到样本中结核分枝杆菌并进行平板计数，达到筛选和分离结核分枝杆菌的目的；
8、④从样本中筛选分离出的结核分枝杆菌可进行再培养，为后续药物耐受性筛选及培养鉴定提供基础。
9、本专利技术解决的技术问题：
10、一是大肠杆菌表面展示技术用于结核分枝杆菌分离鉴定；
11、二是构建重组表达系统，对大肠杆菌外源蛋白——结核分枝杆菌噬菌体多肽进行大肠杆菌体内的重组表达；
12、三是采用his-tag蛋白纯化磁珠(ida-ni)与重组大杆肠菌相结合，得到样品中结核分枝杆菌快速有效筛选分离系统；
13、四是采用甲氧苄啶(tmp)对磁珠融合菌体和培养物处理，达到对大肠杆菌以及其他杂菌灭活。
14、与现有技术相比，本专利技术具有下列优点和积极效果：
15、①该方法对样本要求不高、处理简单、检测的精度高，能够在传播途径(主要包括呼吸道传染、消化道传染、母婴传染)上方便提取样本，进行快速检测。
16、②本方法与传统检测方法的比较，传统的结核分枝杆菌检测方法众多,包括结核菌素皮试、涂片、镜检、分枝杆菌培养、组织病理、结核抗体检测、结核pcr检测等，但受限于假阳性、假阴性率高，敏感性低，无法区分结核或非结核分支杆菌，操作繁琐、实验室要求高等缺点，临床需求仍得不到真正满足。
17、③本专利技术具有灵敏度高、特异性高等特点，其检测结果不受接种卡介苗与否及免疫力功能是否正常等因素影响，能够直接从样本中分离结核分枝杆菌菌株，操作简单，灵敏度高，可有效获取单菌落以便后续开展耐药性筛选等工作。
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1.一种快速分离检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种快速分离检测结核分...
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