【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及增强分离的细胞的治疗功效的方法，该分离的细胞用于细胞疗法，诸如过继性细胞转移疗法。
技术介绍
1、天然存在的或遗传上重定向的肿瘤反应性t细胞的过继转移已成为晚期血液恶性肿瘤和实体癌患者的最成功的免疫治疗性治疗和一般的细胞疗法中的一种。这种治疗方式可以在对常规治疗难以治愈的大部分转移患者中产生完全和持久的应答。过继性细胞转移(act)方法修饰特异性t细胞(自体或同种异体)以增强对肿瘤特异性抗原的靶向，和/或从混合淋巴细胞群中分离肿瘤特异性t细胞。用于癌症免疫疗法的三种act类型包括肿瘤浸润淋巴细胞(til)、t细胞受体(tcr)t细胞和嵌合抗原受体(car)t细胞(1)。
2、car-t细胞由原代t细胞生成，该原代t细胞在分离和扩展后被工程化以表达合成的car–受体，该受体将识别特异性肿瘤相关抗原的细胞外单链抗体结构域(scfv)与来自t细胞受体和共刺激受体的细胞内信号传导结构域组合(2)。就此类修饰而言，car-t细胞对肿瘤细胞的识别和清除依赖于car分子，并且不依赖于传统t细胞受体(tcr)和人白细胞抗原(hla)的结合，从而可以克服由肿瘤细胞中hla的低表达引起的免疫逃逸(3)。目前，大多数car细胞是适于靶向血细胞的car-t(cd8+)细胞。然而，对实体瘤的试验不太受car-t细胞支配，并且采用其它平台诸如nk(天然杀伤)细胞(4)。
3、尽管car-t细胞在血液-肿瘤学领域的临床结果未受到挑战，但是它们的活性与严重的副作用诸如细胞因子释放综合征(crs)和神经毒性相关。此外，这些疗法从
技术实现思路
1、本文描述了基因编辑技术(get)用于修饰分离的细胞的基因表达的应用，该分离的细胞用于细胞疗法，诸如act介导的疗法。
2、get诸如crispr(成簇的规则间隔的短回文重复序列)、talen(转录激活因子样效应物核酸酶)，或zfn(锌指核酸酶)的应用，在rna编码dna区的编辑中提供了非常有力的工具，从而产生新的、内在的和高度表达的rna和/或关闭功能失常的rna。本公开涉及这些技术在特定act环境中，诸如在通过修饰rna的表达来增强car-t细胞功效中的用途，该rna在与癌症靶标接触和被癌症靶标活化时影响t细胞活性。在具体实施方案中，本文所描述的方法涉及修饰选定的编码蛋白质和非编码rna诸如mirna的表达模式。
3、本文所描述的方法利用get作为离体增强造血干细胞、其常见淋巴细胞祖细胞、常见骨髓祖细胞和其更发达(即，单能)谱系细胞类型的治疗功效的治疗手段，用于治疗血细胞相关疾病、自身免疫疾病和癌症。可以通过本文所描述的方法修饰的细胞主要是t细胞或car t细胞，但也包括b细胞、天然杀伤(nk)细胞、调节性t细胞、巨噬细胞、间充质干细胞及其谱系细胞类型。本文所描述的类似方法修饰实质细胞诸如肝细胞，用于治疗肝脏疾病。应了解，除了所提到的细胞类型外，任何类型的多能细胞可以如本文所描述进行修饰。此外，在具体实施方案中，用于特定受试者的细胞是自体的，而在其它实施方案中，细胞是同种异体的。本文所描述的类似方法可以用于修饰实质细胞或内分泌细胞，诸如例如用于移植的肝细胞或胰腺b细胞。
4、目前的方法解决了基于t细胞或car-t细胞的免疫疗法诸如act疗法的主要缺点中的一种。已知在t细胞通过与癌细胞相遇而活化后，基因表达模式，特别是非蛋白质编码rna诸如mirna的基因表达模式的改变作为癌细胞抑制t细胞作用的尝试的一部分而发生。结果，“不良”mirna(对t细胞的治疗效果有害)被上调，并且“良好”mirna(对t细胞的治疗效果有益)被下调，这导致功能失调的t细胞状态，诸如无反应性、耐受性和耗竭。目前描述的方法描述了这样的新方式，其通过在增加“良好”基因的同时抑制“不良”基因的表达，无论是蛋白质编码的还是蛋白质非编码的，诸如例如mirna的表达，来利用get阻断这些对car-t细胞活性的抑制作用，并且可以类似地扩展用于细胞疗法所利用的其它类型的细胞。此外，应了解，在具体实施方案中，通过所描述的方法增强细胞是产生用于细胞疗法的细胞的另外步骤的前兆。
5、在具体实施方案中，get用于编辑离体细胞诸如t细胞中的遗传基因座，以便同时上调期望的(“良好”)mirna和关闭或下调不期望的(“不良”)mirna。
6、一个实施方案涉及编辑单个mirna基因座以将“良好”mirna引入“不良”mirna的活跃转录位点。该编辑事件导致上调现在在“不良”mirna调节元件控制下表达的“良好”mirna，同时关闭该“不良”mirna。
7、另一实施方案涉及编辑单个编码基因座以将“良好”mirna引入“不良”基因的活跃转录位点。该编辑事件导致上调现在在活性“不良”基因调节元件的控制下表达的“良好”mirna，同时通过例如破坏“不良”基因的开放阅读框来关闭该“不良”基因。
8、在另一实施方案中，所描述的方法涉及编辑两个基因座以产生编码序列的相互交换。与用良好mirna替换不良mirna并行，将不良mirna引入到良好mirna的内源基因座以保持不良mirna的基础活性。在具体实施方案中，所描述的方法涵盖在涉及单对基因–一个“不良”和一个“良好”的单个遗传基因座处，通过编辑事件敲减(knocking down)单个“不良”基因。在其它实施方案中，涵盖多个基因敲减编辑事件，包括在“不良”基因的多个遗传基因座处的两个、三个、四个或更多个，其涉及单个或几个不同“良好”基因的敲入(knocking-in)。
9、从以下参考附图进行的具体实施方式中，前述和其它目的、特征和优点将变得更加显而易见。
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1.一种修饰用于细胞疗法的分离的细胞的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在包括所述第二RNA编码序列的第二遗传基因座处插入所述第一RNA编码序列，从而将所述第一RNA编码序列可操作地连接至所述第二遗传基因座处的转录调节序列，
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一RNA编码序列是miRNA编码序列或蛋白质编码序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离的细胞是多能造血干细胞或其谱系，或者间充质干细胞或其谱系。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述分离的细胞是巨噬细胞、天然杀伤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞或肥大细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述T淋巴细胞是天然T细胞、诱导的调节性T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)T细胞、辅助性T细胞或嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离的细胞是实质细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述实质细胞是肝细胞。
9.根据权利要求6所述的方法，其中第二miRNA
10.根据权利要求6所述的方法，其中第一miRNA选自由以下组成的组：miR-146a、miR-31、miR-21和/或miR-23a。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述分离的细胞是调节性T细胞，并且其中所述第二miRNA是miR-146a，且所述第一miRNA是miR-17。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二RNA是miR-222、miR-191和/或miR-224。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一RNA是miR-27a。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二RNA是miR-222、miR-191或miR-224。
15.一种增强用于过继性细胞转移的淋巴细胞的治疗功效的方法，其包括：
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述蛋白质编码基因是抑制性免疫检查点基因。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二miRNA编码序列是miR-181a、miR-28或miR-149-3p。
18.根据权利要求15所述的方法，其中在插入所述第二miRNA编码序列之前，通过基因编辑技术切除所述第一miRNA编码序列。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种修饰用于细胞疗法的分离的细胞的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在包括所述第二rna编码序列的第二遗传基因座处插入所述第一rna编码序列，从而将所述第一rna编码序列可操作地连接至所述第二遗传基因座处的转录调节序列，
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一rna编码序列是mirna编码序列或蛋白质编码序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离的细胞是多能造血干细胞或其谱系，或者间充质干细胞或其谱系。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述分离的细胞是巨噬细胞、天然杀伤细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞或肥大细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述t淋巴细胞是天然t细胞、诱导的调节性t细胞、细胞毒性t细胞、天然杀伤(nk)t细胞、辅助性t细胞或嵌合抗原受体(car)t细胞。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离的细胞是实质细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述实质细胞是肝细胞。
9.根据权利要求6所述的方法，其中第二mirna选自由以下组成的组：mir-181a、mir-28和/或mir-149-3p。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·祖尔，夏甲·卡林斯基，埃琳娜·范斯坦，
申请(专利权)人：莱普顿制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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