【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种人诱导多能干细胞诱导分化建立内耳类器官的方法。
技术介绍
1、内耳是人体的一个重要器官，位于耳道的最深处，负责处理听觉和平衡信息。内耳主要由耳蜗和前庭两个部分组成。耳蜗是内耳的主要部分，负责处理声音信息。当声音传入耳朵时，会引起耳膜和听骨链的振动，这种振动会传递到耳蜗，刺激耳蜗内的毛细胞产生电信号，然后这些电信号会被送到大脑，被转化为声音。前庭是内耳的一个小囊，负责处理平衡信息。前庭内有三个半规管，当我们的身体移动时，半规管内的液体会产生运动，刺激前庭内的毛细胞产生电信号，然后这些电信号会被送到大脑，帮助我们感知身体的位置和运动。内耳的疾病主要包括耳聋、耳鸣和平衡障碍等。目前常用的耳聋模型主要是二维建模和动物模型，但二维培养系统无法模拟哺乳动物内耳形态形成的复杂的三维过程，也无法模拟成人内耳及其胚胎祖先的精确的三维空间组织，而动物与人类的生长发育存在较大差异，无法准确模拟人的内耳发育过程中的复杂问题。因此，急需一种能够反映人体内耳真实生理功能的内耳疾病模型进行实验和临床研究。
2、类器官是一种实验室中培育的微型人体组织，它们可以模拟人体内的某些功能。在医学研究中，内耳类器官可以用来研究耳聋、耳鸣等内耳疾病的发病机制，也可以用于药物筛选和毒性测试。内耳类器官的培养通常需要使用干细胞技术，通过诱导多能干细胞(ipscs)或者胚胎干细胞(escs)分化成内耳相关的细胞类型，然后将这些细胞组装成类似于内耳的结构。这些结构可以模拟内耳的各种功能，包括听觉、平衡和前庭功能。
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技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种人诱导多能干细胞诱导分化建立内耳类器官的方法，所述方法包括：人诱导多能干细胞培养、拟胚体的诱导、拟胚体的分化、耳泡形成和内耳类器官成熟。
2、本专利技术采取的具体技术方案是：
3、一种人诱导多能干细胞诱导分化建立内耳类器官的方法，所述方法包括如下步骤：
4、(ⅰ)人诱导多能干细胞培养：
5、(s1)、将人诱导多能干细胞用nc target培养基培养在matrigel包被的培养板上，培养板放置在细胞培养箱中进行培养，待细胞密度达到75％-85％时，用edta消化成小的细胞团块；
6、(s2)、将步骤(1)培养的人诱导多能干细胞用nc target培养基传代接种在新的matrigel包被的培养板上，继续在细胞培养箱中进行培养，24小时后更换培养基继续培养；
7、(ii)拟胚体的诱导-分化第-2-7天：(第-2天指的是分化培养前倒数第2天，24小时为1天)
8、(s1)、传代培养48小时后，细胞长到70-90％的密度，弃去旧的nc target培养基，用预温的pbs洗一次后加入1ml/孔的trypletm express置于培养箱消化5min后迅速吸弃；加入1ml/孔dmem/f12混匀细胞，将细胞悬液移入空的离心管中，随后缓慢加入9ml dmem/f12，20μly27632，200g离心5min，离心后吸弃上清，用5ml nc target重悬，以每孔100μl接种至超低吸附圆底96孔板，封好封口膜；820rpm离心3min，揭去封口膜，于细胞培养箱中继续培养24小时；
9、(s2)、24小时后，进入分化第-1天，(分化第-1天，第-1天指的是分化培养前倒数第1天)，每孔加入100μl nc target，达到每孔200μl，将培养板放置在细胞培养箱中继续培养24小时；
10、(s3)、24小时后，进入分化第0-3天，(分化第0-3天，第0天是指开始进行分化培养到满24小时，第0-3天对应下面所述的培养4天)，吸弃培养基，加入100μl/孔分化cdm培养基，在细胞培养箱中培养4天；
11、(s4)、分化第4-7天，将32.5μl的50μg/ml fgf2和1.3μl 5mm的ldn-193189加入到1.267ml步骤(s3)培养后的cdm培养基中，放置在细胞培养箱中孵育4天；
12、(ⅲ)拟胚体分化-分化第8-11天：
13、将15.6μl的5mm chir-99021(chir)加入到1.285ml步骤(s4)培养后的cdm中，放置在细胞培养箱中培养4天；
14、(ⅳ)耳泡形成阶段-分化第12-18天：
15、在第11天准备20ml类器官成熟培养基(omm)，储存在4℃，或者，在第12天准备20ml类器官成熟培养基(omm)，使用前需在冰上冷藏至少30min；并在第11天从-20℃取出基质胶到4℃过夜解冻；
16、将100μl的解冻过的基质胶移至10ml的冷omm中，反复将冷omm移至基质胶管中；待基质胶完全转移到omm后，反复吹打溶解基质胶；
17、在10ml的omm+基质胶中加入20μl 5mm chir，混合均匀，加热到rt；
18、将产生的聚集体转移到1个常规100mm培养皿，然后再将聚集体转移到1个2ml ep管中；
19、用1-2ml的dpbs洗涤聚集体2次，用1ml的omm+基质胶+chir洗涤1次；
20、将1ml的omm+基质胶+chir加入到ep管中，将聚集体转移到1个新的常规100mm培养皿，并补充至10ml；
21、将100mm的培养皿放入细胞培养箱中，孵育3天后，加入10ml omm+20μl 5mm chir；
22、分化第15天，使用前加热omm至rt或37℃，加入10ml omm+20μl5mm chir；
23、将培养皿放回细胞培养箱中，继续孵育3天；
24、(ⅴ)内耳类器官成熟阶段-分化第19天至成熟(分化第60天左右，一般在分化第50-70天)：
25、将培养皿中的聚集体转移到新的常规100mm培养皿中，并加入10ml omm，把培养皿放回细胞培养箱培养至成熟。
26、进一步地，所述人诱导多能干细胞可由人皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞重编程获得。包括但不限于人体的血液细胞、皮肤细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、尿液细胞等。
27、进一步地，所述细胞培养箱的培养条件是：37℃、5％co2。
28、进一步地，所述人诱导多能干细胞培养中，步骤(s2)继代培养细胞接种密度为1×105/cm2的细胞密度；步骤(s2)先采用加入了10μm的rock inhibitor(y-27632)的nc target培养基进行传代培养，24小时后更换不含y27632的nc target培养基继续培养。
29、进一步地，所述拟胚体的诱导中；
30、步骤(s3)加入100μl/孔分化cdm培养基后用排枪轻轻吹打，使eb悬浮；
31、步骤(s4)具体为：在e本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人诱导多能干细胞诱导分化建立内耳类器官的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人诱导多能干细胞可由人皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞重编程获得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养箱的培养条件是：37℃、5％CO2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人诱导多能干细胞培养中，步骤(S2)继代培养细胞接种密度为1×105/cm2的细胞密度；步骤(S2)先采用加入了10μM的Rockinhibitor(Y-27632)的nc Target培养基进行传代培养，24小时后更换不含Y27632的ncTarget培养基继续培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拟胚体的诱导中；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拟胚体分化具体操作为：在EP管中，将15.6μl的5mM CHIR-99021加入到1.285ml拟胚体的诱导步骤(S4)培养后的CDM中，吹打混匀，并将内容物倒入加样槽，每孔加入25μl含CHIR的CDM，轻轻
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耳泡形成阶段，将100mm的培养皿放入细胞培养箱中，孵育3天后，需先仔细地抽吸用过的介质，但不要抽吸聚集体，然后加入10mlOMM+20μl 5mM CHIR；并且将培养皿放回细胞培养箱中，继续孵育3天的过程中，若出现贴壁，则轻轻吹下贴壁细胞，并将所有聚集体转移至新的培养皿进行培养；分化第15天，在加入10ml OMM+20μl 5mM CHIR之前，先仔细地抽吸用过的介质，但不要抽吸聚集体。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内耳类器官成熟阶段，使用宽口p1000移液器尖端,将培养皿中的聚集体转移到新的常规100mm培养皿中后，需仔细抽吸过量的废液,然后再加入10ml OMM，把培养皿放回细胞培养箱培养至成熟，培养过程中每4天换一次液。
9.根据权利要求1-8任意一种所述的方法，其特征在于，在人诱导多能干细胞诱导分化建立内耳类器官过程中对内耳类器官进行免疫荧光染色鉴定，具体方法为：收集内耳类器官于2ml EP管中，待类器官自然沉降后，弃上层培养基，吸取1ml 4％PFA加入类器官沉淀悬液中，轻轻摇晃混匀，于4℃过夜存放，隔天进行染色；染色时，所用的标记物为：在第20-40天聚集体中，PAX2、PAX8、ECAD(CDH1)、NCAD(CDH2)、FBXO2、JAG1、SOX2和SOX10在耳部祖细胞中表达；在第50-70天聚集体中，MYO7A、ATOH1、POU4F3、ANXA4、PCP4、CALB2和SOX2在耳部毛细胞中表达。
10.一种内耳类器官，其特征在于，由权利要求1-8任意一种所述的方法建立。
...【技术特征摘要】
1.一种人诱导多能干细胞诱导分化建立内耳类器官的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人诱导多能干细胞可由人皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞重编程获得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养箱的培养条件是：37℃、5％co2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人诱导多能干细胞培养中，步骤(s2)继代培养细胞接种密度为1×105/cm2的细胞密度；步骤(s2)先采用加入了10μm的rockinhibitor(y-27632)的nc target培养基进行传代培养，24小时后更换不含y27632的nctarget培养基继续培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拟胚体的诱导中；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拟胚体分化具体操作为：在ep管中，将15.6μl的5mm chir-99021加入到1.285ml拟胚体的诱导步骤(s4)培养后的cdm中，吹打混匀，并将内容物倒入加样槽，每孔加入25μl含chir的cdm，轻轻移液8-10次混匀，然后放置在细胞培养箱中培养4天。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耳泡形成阶段，将100mm的培养皿放入细胞培养箱中，孵育3天后，需先仔细地抽吸用过的介质，但不要抽吸聚集体，然后加入10mlomm+20...
【专利技术属性】
技术研发人员：王荣浩，汪刘华，廖清楠，曾奋，
申请(专利权)人：厦门逸漠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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